蜂胶对脂质过氧化的抑制作用

【摘要】采用Fe²⁺诱导卵黄脂蛋白多不饱和脂肪酸发生脂质过氧化反应为模型,以硫代巴比妥酸反应物的光密度值为指标,观察了蜂胶对Fe²⁺诱导的脂质过氧化反应的抑制作用,结果表明,蜂胶可以抑制Fe²⁺诱导的脂质过氧化反应,呈现量效关系,同时对已受Fe²⁺诱导的脂质过氧化反应有一定的延缓和阻断作用,效果优于同浓度的芦丁和槲皮素。

【作者】 曹炜  宋纪蓉  陈卫军

【关键词】蜂胶 脂质过氧化 抑制作用

目前研究认为,脂质过氧化与癌症、动脉粥样硬化、衰老、自身免疫疾病、炎症、辐射损伤等疾病的发生和发展密切相关^[1]。因此,如何防止机体细胞成分发生脂质过氧化对预防上述疾病十分重要。已有研究报道,芦丁、槲皮素等生物黄酮化合物能明显抑制Cu²⁺和巨噬细胞介导的脂质过氧化反应,并呈现一定的量效关系^[2],流行病学调查也发现,每日摄取一定量的生物黄酮有助于健康^[3],其主要原因在于黄酮类化合物具有抗脂质过氧化反应。蜂胶是蜜蜂从植物中采集的树胶,混入蜜蜂的上颚腺分泌物和蜂蜡而成的树脂状固体物质,富含多种黄酮类化合物。我们曾在蜂胶的抗氧化作用研究中发现,蜂胶对氧自由基有很强的清除作用^[4]。本文进一步研究蜂胶对脂质过氧化的抑制作用,为开发蜂胶保健食品提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 蜂胶 由陕西省蜂业公司提供,按照SB1Tll0096-92标准鉴定。蜂胶的提取按照文献[5]方法,配制成0.4mg/ml的乙醇溶液,置冰箱备用。

1.1.2 试剂  芦丁、槲皮素 均购自中国药品生物制品鉴定所;硫代巴比妥酸、硫酸、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、三氯乙酸 均为国产分析纯;所用水为取离子水。

1.2 仪器水浴恒温振荡器  SHA-B,常州国华电器有限责任公司生产;紫外可见光分光光度计 751-GW,上海分析仪器厂生产。

1.3 方法

1.3.1脂质过氧化产物的测定

参考文献^[6]方法,反应体系包括:1:25稀释的卵黄悬浊液0.2ml则(卵黄用等体积的pH7.40 0.lmol/L磷酸缓冲液(PBS)配成,用前用磁力搅拌10min),加入不同体积的样品液,25mmol/L FeSO4·7H2O溶液0.2ml,用PBS补足2ml,对照管除不加样品溶液外其它试剂同前,并提前加入50%三氯乙酸溶液0.5ml,对照管与样品管同置37℃水浴温育4h,取出后加入50%三氯乙酸0.5ml,再加0.8%硫代巴比妥酸(TBA)lml,混匀,置100℃水浴20min,冷却后3500r/min离心15min,取3ml上清液在751-GW分光光度计上测定532nm处的光密度值。

1.3.2 蜂胶对Fe²⁺诱发卵黄脂蛋白多不饱和脂肪酸脂质过氧化的抑制作用

1.3.2.1 将卵黄悬浮液分成6组,每组加入蜂胶使其终浓度为2、4、6、8、12、16μg/ml,各组加入Fe²⁺至终浓度2.5mmol/L,37℃温育4h,过氧化产物测定方法同前(1.3.1)。

1.3.2.2 将卵黄悬浮液分成6组,条件同①,每组加人芦丁,槲皮素使其终浓度分别为2、4、6、8、12、16μg/ml,过氧化产物测定同前(1.3.1)。

1.3.3蜂胶对已发生脂质过氧化反应的抑制作用反应体系中加入Fe²⁺至浓度为lmmol/L,37℃水浴温育2h,然后分成4组,即对照组、蜂胶组、芦丁组和槲皮素组,加入不同剂量的抗氧化剂,继续温育至6h,测定体系中的过氧化产物,每样品平行测定3次。

1.3.4 计算方法

2 结果

2.1 Fe²⁺诱导卵黄脂蛋白多不饱和脂肪酸脂质过氧化的动力学变化

卵黄中磷脂C-2位上所含的多不饱和脂肪酸在铁离子的催化下,经37℃温育培养能诱导发生脂质过氧化,产生烷氧自由基(LO·)和烷过氧自由基(LOO·),再进一步引发链式反应。在加热条件下,过氧化产物可与TBA(硫代巴比妥酸)反应生成红色化合物,在波长532nm处有显著的光吸收。从图1可以看出,Fe²⁺诱导2h内过氧化产物以较大的速率增加,至4h,产生趋缓,至6h趋于稳定。该结果与文献报道基本一致^[6]。因此,本试验以37℃,温育4h作为评价蜂胶抗Fe²⁺诱导脂质过氧化的反应条件。

2.2 蜂胶对Fe²⁺诱导卵黄脂蛋白多不饱和脂肪酸过氧化反应的抑制作用

不同浓度的蜂胶、芦丁、槲皮素与Fe²⁺存在条件下与卵黄悬浮液共同温育,其对卵黄脂蛋白多不饱和脂肪酸过氧化反应的抑制率见图2。

由图2可见,蜂胶、芦丁、槲皮素均对Fe²⁺诱导的卵黄脂蛋白多不饱和脂肪酸过氧化反应有明显的抑制作用,呈现量效关系,蜂胶对Fe²⁺诱导的卵黄脂蛋白多不饱和脂肪酸产生过氧化反应的抑制作用明显强于同剂量的芦丁和槲皮素。当反应体系中蜂胶加入量为20μg/ml时,其抑制率为90.5%,芦丁和槲皮素在同浓度下的抑制率分别为81.7%和82.3%。

2.3 蜂胶对已发生脂质过氧化反应的抑制作用

将卵黄脂蛋白多不饱和脂肪酸受Fe²⁺诱导氧化修饰2h后,过氧化产物有较明显的增加,此时分别加入不同剂量的蜂胶、芦丁和槲皮素,然后继续在37℃水浴中温育4h,测定过氧化产物的光密度值,计算对已发生脂质过氧化反应的抑制率,结果见图3。

从图3可以看出,蜂胶、芦丁、槲皮素对已受Fe²⁺诱导的卵黄脂蛋白多不饱和脂肪酸的过氧化反应均有延缓和抑制作用,蜂胶的抑制作用较芦丁和槲皮素明显。

3 讨 论

在37℃温育条件下,Fe²⁺可诱导多不饱和脂肪酸发生脂质过氧化反应,对细胞膜和生物大分子造成氧化损伤,其反应机理至今仍不是十分清楚。当反应体系中预先加入黄酮类化合物后,脂质过氧化反应明显被抑制,该方法己在药物和保健食品功能成分筛选中得到了广泛的应用。蜂胶中含有多种生物黄酮化合物,占蜂胶总重量的13%以上,主要有槲皮素、桑黄素、高良姜素、山萘素、洋槐黄素等。本研究表明,蜂胶对Fe²⁺诱导的卵黄脂蛋白多不饱和脂肪酸的过氧化反应有很强的抑制作用,其抑制作用明显高于芦丁和槲皮素。预先用Fe²⁺诱导卵黄脂蛋白多不饱和脂肪酸发生脂质过氧化反应,然后在反应体系中加人蜂胶提取液,发现蜂胶对己经发生的脂质过氧化反应有明显的延缓和抑制作用,最大抑制率为69%,高于同剂量芦丁和槲皮素的抑制率。

黄酮类化合物是广泛存在于植物中的多酚抗氧化剂,Herterg等根据流行病学调查[3],分析了黄酮类物质摄入量与冠心病发生、发展的关系,结果表明,黄酮类物质摄入量与冠心病的例数及心肌梗塞的发生率呈负相关。黄酮类化合物在预防动脉粥样硬化病方面也得到了证实。蜂胶中含有丰富的黄酮类化合物,它们在抗脂质过氧化反应中可能具有相乘效应,这在本实验中也得到了初步的证明。另外,蜂胶中可能存在着抗氧化活性比芦丁和槲皮素更强的物质,有待进一步深入研究。

参考文献：

[1]Stephen bedwell,Rogert dean,WendyJessup.The action ofdefined oxygen-centred free radicals on hmanlow-densitylipoproteln[J].BiochemJ,1989,262:707.

[2]陈媛,周玫.LDL的抗氧化修饰和氧化修饰LDL的组成和结构变化.生物物理学报,1993,9(2):334.

[3]阎道广,周玫,陈媛.芦丁和槲皮素对低密度脂蛋白氧化修饰的抑制作用.生物物理学报,1995,11(1):105-108.

[4]曹炜,尉亚辉,郭斌.用化学发光法研究蜂胶对氧自由基的抑制作用.光于学报,2002,31(2):162-164.

[5]曹炜.陕西师范大学博士学位论义.2001.20.

[6]张尔先,余利君,周意琳.Fe²⁺诱发脂蛋白PUFA过氧化体系及对若干天然产物抗氧化作用的评价[J].生物化学与生物物理学报,1996,28(2):218.陕西自然科学基金资助课题(2000SM16)