蜂胶抗衰老机制探讨

目的:随着年龄的增长,老年机体患感染性疾病、自身免疫病、肿瘤等疾病的机率明显增加。因此降低老年机体忠病的机率,增强抵抗力,研究延缓衰老的方法对于积极地预防疾病、延长寿命、提高生存质量具有重要的意义。

本实验分别用高龄小鼠和损伤的血管内皮细胞作为实验模型。高龄模型小鼠用蜂胶灌胃、体外培养的损伤的血管内皮细胞加入适量蜂胶,以小鼠的NK细胞杀伤活性、M中细胞吞噬功能、脾脏淋巴细胞增殖活性、IL-1和[L-2的活性、脑组织中丙二醛(MDA)的含量和超氧化物歧化酶(SOD)的活性作为体内实验检测指标;以损伤的血管内皮细胞的细胞存活数和DNA的合成、以及LPS致血管内皮细胞表达的细胞间黏附分子-1(ICAM-1)作为体外实验的检测指标,目的在于观察蜂胶对老年机体免疫功能的影响和对损伤细胞的保护作用,并对其作用机理进行研究和探讨,为蜂胶产品的临床应用及其抗衰老的保健作用提供实验依据。

关键词:蜂胶抗衰老高龄小鼠/血管内皮细胞/氧化损伤ICAM-1hutALCOM

作者：王伟河北医科大学

方法:实验分为体内实验和体外实验两部分。体内实验:将高龄(20月龄)BALB/c小鼠随机分为4组,每组10只:高龄对照组(蒸馏水灌胃0.3ml/只);低剂量实验组(蜂胶灌胃20mg/Kg体重);中剂量实验组(蜂胶灌胃33mg/Kg体重);高剂量实验组(蜂胶灌胃80mg/Kg体重);7月龄BALB/c小鼠作为低龄对照组(蒸馏水灌胃0.3ml/只),每天一次,连续4周后,用乳酸脱氢酶法分别测小鼠脾脏NK细胞活性、腹腔MΦ细胞吞噬活性,四甲基偶氮唑蓝(MTT)法测定脾脏淋巴细胞转化率及蜂胶对经过过氧化氢(H₂O₂)损伤后的脾细胞的淋巴细胞增殖活性。小鼠胸腺细胞增殖法测腹腔M中细胞IL-1和脾脏淋巴细胞IL-2的活性,比色法测小鼠脑组织中MDA含量和SOD活性。

体外实验:将血管内皮细胞(VEC)接种于96孔的细胞培养板,接种密度为1×10⁴个/孔,每孔设3个复孔。分以下二部分进行实验。

第一部分:蜂胶对H₂O₂损伤的血管内皮细胞(VEC)的保护作用:实验分4组,每组8例:对照组(10%NCS的DMEM细胞培养液培养);各浓度蜂胶组(蜂胶浓度分别为4×10^-4mg/ml、4×10^-3mg/ml、4×10^-2mg/ml培养24小时);H₂O₂组(H₂O₂浓度为100mol/L);蜂胶保护组(蜂胶浓度为4×10^-4mg/ml、4×10^-3mg/ml、4×10^-2mg/ml培养24小时后用100u mol/L的H₂O₂刺激4小时)。MTT比色法检测细胞存活数量,BUdR渗入法检测细胞DNA合成。

第二部分:蜂胶对LPS致VEC表达ICAM-1的影响实验分4组,每组8例:对照组(10%NCS的DMEM细胞培养液培养24小时);蜂胶组(蜂胶浓度为4×10^-3mg/ml培养24小时);各浓度LPS组(LPS浓度分别为1ug/ml、2ug/ml、3ug/ml、4ug/ml和5ug/ml的刺激12小时);蜂胶+各浓度LPS组(加入浓度为4×10^-3mg/ml蜂胶培养24小时后,分别以1ng/ml、2ug/ml、3ug/ml、4lg/ml和5ug/ml的LPS刺激12小时)。免疫组化法检测细胞间黏附分子-1(ICAM-1)的表达。

结果:1.NK细胞杀靶试验比较用乳酸脱氢酶(LDH)释放法测定NK细胞活性。低龄对照组为52.03%±3.16%,高龄对照组为35.82%±11.23%,明显低于低龄对照组(p<0.01)。低剂量组为43.84%±6.28%,中剂量组为50.74%±2.01%,高剂量组为48.46%±0.19%。经统计学分析三个剂量组NK细胞活性均高于高龄对照组,其中,中剂量组NK细胞活性明显高于高龄对照组(p<0.01),低、高剂量组与高龄对照组相比无明显统计学差异(p>0.05)。

2.淋巴细胞增殖试验

用MTT法检测淋巴细胞增殖活性,用刺激指数(S1)表示。低龄对照组为176±0.499,高龄对照组为1.287±0.186,高龄对照组淋巴细胞增殖活性明显低于低龄对照组(p<0.01)。低剂量组为2.193±0.157,中剂量组为1.72±0.211,高剂量组为2.207±0.416。三个剂量组SI均明显高于高龄对照组(p<0.01)。

3.蜂胶对脾脏淋巴细胞的氧化损伤的保护作用

用MTT法检测H₂O₂对脾脏淋巴细胞的氧化损伤后淋巴细胞增殖活性,用SI(刺激指数)表示。低龄、高龄对照组分别为176±0.499、1.287±0.186,高龄对照组淋巴细胞增殖活性明显低于低龄对照组(p<0.01)。经100mmol/LH,O,处理的低龄、高龄损伤组分别为1.865±0.448、0.947±0.158,低龄损伤组低于低龄对照组,但无明显统计学意义(p>0.05),高龄损伤组明显低于高龄对照组(p<0.01)。经100mmoI/LH,O,处理的低、中、高剂量蜂胶保护组分别为1.702±0.108、1.528±0.208、1.814±0.348,均明显高于高龄对照组(p<0.01)。

4.MΦ细胞吞噬功能的检测

用乳酸脱氢酶(LDH)释放法测量其吞噬活性。低龄对照组吞噬活性为19%±21.01%;高龄对照组为8.58%±5.77%,明显低于低龄对照组(p<0.01)。低剂量组吞噬活性为59.60%±10.96%,中剂量组为63.15%±9.17%,高剂量组为60.70%±6.11%。三个剂量组吞噬活性均明显高于高龄对照组(p<0.01)。

5.IL-1的检测

小鼠胸腺细胞增殖法测IL-1的活性,用A值表示。低龄对照组和高龄对照组的A值分别为106±0.006、0.075±0.013,高龄对照组IL-1的活性明显低于低龄对照组(p<0.01)。低、中、高剂量组A值分别为0.094±0.009、0.109±0.007和0.104±0.005。三个剂量组IL-1的活性均高于高龄对照组(p<0.05)。

6.IL-2的检测

小鼠胸腺细胞增殖法测IL-2的活性,用A值表示。低龄对照组和高龄对照组A值分别为161±0.011、0.119±0.008,高龄对照组IL-2的活性明显低于低龄对照组(p<0.01).低、中、高剂量组A值分别为0.169±0.0140.165±0.005、0.169±0.003。三个剂量组IL-2的活性均高于高龄对照组(p<0.05)。

7.MDA测定

硫代巴比妥酸(TBA)法测小鼠脑组织中MDA含量,以nmol/mgprot单位表示。低龄对照组为351±0.212,高龄对照组为1.854±0.345,明显高于低龄对照组MDA的含量(p<0.01)。低、中、高剂量组分别为1.711±0.107、1.542±0.191和1.452±0.085。低、中、高剂量组MDA的含量均低于高龄对照组,但低剂量组与高龄对照织相比无明显统计学差异(p>0.05),中、高剂量组与高龄对照组相比有差异(p<0.05)。

8.SOD测定

用黄嘌呤氧化酶法测量小鼠脑组织中SOD活性,以NU/mgprot单位表示。低龄对照组为401.242±63.763,高龄对照组为318.207±124.345,低于低龄对照组SOD活力,但无明显统计学差异(p>0.05)。低、中、高剂量组SOD活力分别为510.105±71.894、581.538±111.209、503.120±150.211。低、中、高剂量组SOD活力均高于高龄对照组(p<0.05)。

9. 蜂胶对H₂O₂诱导VEC氧化损伤的保护作用

MTT法检测细胞存活数,用A值表示。对照组A值为0.136±0.014,H₂O₂损伤组A值为0.073±0.016,对照组明显高于H₂O₂组(p<0.01)。最适蜂胶浓度为4×10^-3mg/ml时,蜂胶保护组A值为0.172±0.016,明显高于H₂0₂损伤组(p<0.01)。

10.蜂胶对H₂O₂诱导VEC损伤后DNA合成的影响BUdR渗入法测定。染色结果经图像分析软件处理,用平均光度值(OD)表示。对照组为116±0.070,H,0,组为0.091±0.060,蜂胶保护组为0.105±0.045,对照组明显高于H₂O₂组(p<0.01),蜂胶保护组明显高于H.Q,组(p<0.05)。

11.蜂胶对LPS致VEC表达ICAM-1的影响免疫组化法测定。染色结果经图像软件处理,用平均光度值(OD)表示。对照组为093±0.054,浓度为1ug/ml、2ng/ml、3ug/ml、4ug/ml、5ug/mlLPS组分别为0.108±0.064、0.156±0.106、0.171±0.135、0.177±0.120、0.208±0.174;蜂胶+1ug/ml、2ug/ml、3ug/ml、4ug/ml和5ug/ml的LPS组分别为0.101±0.060、0.119±0.045、0.130±0.108、0.134±0.074、0.189±0.103。经统计学分析,浓度为2ug/ml、3ug/ml、4ug/mlLPS组分别明显高于蜂胶+2ug/ml、3pg/ml、4ug/ml的LPS组(p<0.01)。

结论:

1.蜂胶浓度在22-80mg/Kg范围内可以提高高龄小鼠的NK细胞活性、淋巴细胞增殖指数、M中细胞吞噬功能及IL-1和IL-2的活性。

2.蜂胶浓度在22-80mg/Kg范围内具有提高高龄小鼠抗氧化的作用。蜂胶可以降低衰老小鼠脑组织MDA的含量,并能提高其SOD活性;同时蜂胶还能增强高龄小鼠脾脏淋巴细胞对H₂O₂的氧化损伤的保护作用。

3.蜂胶浓度在4×10^-4mg/ml-4×10^-3mg/ml范围内对HO,诱导VEC氧化损伤有保护作用。4×10^-3mg/ml的蜂胶不但可以促进正常VEC的DNA合成,还可以促进H₂0₂诱导VEC的DNA合成。

4.4×10^-3mg/ml的蜂胶能下调浓度在2ug/ml-4ug/ml LPS致VEC的ICAM-1表达水平。