蜂胶黄酮脂质体免疫增强活性的研究

蜂胶是维持蜜蜂整个群体健康的有效物质，它不仅能够维持蜂巢结构的稳定性，还对于蜂巢内环境的稳定起着决定性的作用。现代研究发现，蜂胶具有抗氧化、抗炎、抗菌、抗肿瘤等广泛的生物活性。蜂胶成分随着产地的不同而存在差异，其中黄酮含量的高低是评估蜂胶品质的重要指标。

脂质体是一种总体结构类似于细胞外层，由磷脂双分子层构成的球形小体。因此，极性物质可以被包裹在脂质体球形结构内部，还可以被镶嵌在双分子之间，从而极大地提高了极性物质在非极性溶剂中的溶解度。脂质体具有良好的缓释效应，能够降低药物的毒性，修饰后的脂质体还具有良好的靶向性。脂质体因此可以作为药物的潜在运送载体和疫苗的低刺激性佐剂。

将低水溶性的蜂胶黄酮包封于脂质体中，一方面极大地提高了蜂胶黄酮在水溶液中的溶解度，另一方面同时利用了蜂胶黄酮的生物学活性和脂质体良好的载体效应。本试验通过研究蜂胶黄酮脂质体的微观结构以及缓释情况、蜂胶黄酮脂质体对脾脏淋巴细胞、腹腔巨噬细胞、树突状细胞等免疫细胞的作用、蜂胶黄酮脂质体作为佐剂的效果，旨在开发出一种具有广阔的应用前景、质量可控的现代化中兽药制品。

试验由以下五个部分构成：试验Ⅰ蜂胶黄酮脂质体的制备及其物理性状采用优化的条件制备蜂胶黄酮脂质体。首先，分别使用粒径分析仪和透射电镜对蜂胶黄酮脂质体的平均粒径和微观形态进行测定和观察；其次，以高良姜素和白杨素的包封量为指标，以PBS为释放介质，分别在特定时间点测定蜂胶黄酮脂质体的包封率。

结果显示，蜂胶黄酮脂质体的粒径分布在0.03μm至1μm之间，平均粒径约为100nm，在透射电镜下可以看到明显的具有指纹状结构的脂质体结构；蜂胶黄酮脂质体体外释放曲线符合一级方程公式，半衰期约为4.0h。

试验Ⅱ蜂胶黄酮脂质体对小鼠脾脏淋巴细胞增殖的影响将5种浓度的蜂胶黄酮脂质体、蜂胶黄酮和空白脂质体分别单独或与PHA、LPS同时加入到体外分离的小鼠脾脏淋巴细胞中，用MTT法测定脾脏淋巴细胞增殖的变化。结果表明，药物浓度在3.7530ug·mL-1范围内，蜂胶黄酮脂质体能够显著刺激淋巴细胞的增殖，同时效果明显优于蜂胶黄酮；在3.7530ugnmL-1范围内，蜂胶黄酮脂质体能够显著协同PHA刺激淋巴细胞的增殖，在7.530ug·mL-1范围内，效果显著高于蜂胶黄酮；在3.7515ug·mL-1范围内，蜂胶黄酮脂质体能够显著协同LPS刺激淋巴细胞的增殖，在3.75和15 ug·mL-1时，效果显著优于蜂胶黄酮。

试验Ⅲ蜂胶黄酮脂质体对小鼠骨髓树突状细胞的影响为了探讨蜂胶黄酮脂质体对小鼠骨髓树突状细胞的影响，本试验首先从小鼠骨髓中分离细胞，用rmG-CSF和rmIL-4诱导分化成树突状细胞(DCs)。将培养至第7天的DCs经蜂胶黄酮脂质体刺激48小时后，与经完全氟氏佐剂(FCA)包裹OVA免疫过的小鼠脾淋巴细胞、OVA混合培养，用MTT法检测药物DCs抗原递呈能力的影响；将培养至第7天的DCs经蜂胶黄酮脂质体刺激48小时后，与小鼠脾淋巴细胞混合培养，用MTT法检测药物DCs激活并刺激脾脏淋巴细胞增殖能力的影响；最后将培养至第7天的DCs经蜂胶黄酮脂质体刺激48小时后，检测细胞表面MHC-II、CD80以及CD86阳性表达的细胞比率。

结果显示，蜂胶黄酮脂质体不仅能显著增强DCs抗原提呈能力，而且能有效激活并刺激脾脏淋巴细胞的增殖，同时能够提高小鼠骨髓DCs表面MHC-II、CD80以及CD86的阳性表达率。试验Ⅳ蜂胶黄酮脂质体对小鼠腹腔巨噬细胞功能的影响为了探究蜂胶黄酮脂质体对小鼠腹腔巨噬细胞的影响，6%的淀粉肉汤被注入到小鼠腹腔内。2天后处死小鼠，洗涤腹腔，收集腹腔液，分离培养腹腔巨噬细胞。细胞贴壁后，向细胞中分别加入3中不同浓度的蜂胶黄酮脂质体、蜂胶黄酮和空白脂质体。

培养48小时后，分别吸取上清液测定IFN-γ、IL-1α、IL-6、IL-12、TNF-α浓度以及加入荧光标记的大肠杆菌测定巨噬细胞吞噬能力。结果显示，蜂胶黄酮脂质体能够显著促进小鼠腹腔巨噬细胞所分泌IFN-γ、IL-1α、IL-6的量以及吞噬大肠杆菌的能力。

试验Ⅴ蜂胶黄酮脂质体对OVA免疫效果的影响为探所蜂胶黄酮脂质体对用OVA免疫的小鼠的影响，将120只5周龄的小鼠雌雄各半随机均分为5组，分别以蜂胶黄酮脂质体、空白脂质体、蜂胶黄酮、弗氏完全佐剂以及生理盐水为佐剂的OVA进行皮下免疫，并于2周后进行二免。于首免后第7、14、21、28、35、42 d摘眼球采血，采用ELISA法测定IgG、IL-4和IFN-lγ的浓度变化；每组小鼠雌雄各半共扑杀4只，无菌取脾脏，分离脾脏淋巴细胞，采用MTT法测定脾脏淋巴细胞分别协同PHA和LPS时的增殖情况。

结果表明，蜂胶黄酮脂质体能够在某些时间点显著增加血清中IgG、IL-2和IFN-γ的浓度，促进小鼠脾脏淋巴细胞增殖。综上可知，蜂胶黄酮脂质体具有良好的佐剂活性。

（来源：蜂胶黄酮脂质体免疫增强活性的研究，陶阳，南京农业大学）