蜂胶超临界CO2萃取物的体外抗肿瘤试验研究

[摘要] 目的:研究蜂胶的超临界CO₂萃取物的体外抗肿瘤作用。方法:以蜂胶的超临界CO₂萃取物(SE-P)为原料,采用MTT法研究其对U937、95D、SGC2 7901和TE21共4株肿瘤细胞的体外抑制作用,并与市售蜂胶乙醇提取物(ME-P)和蜂胶超临界CO₂萃余物95%乙醇提取物(RE-P)的抗肿瘤活性进行对比。结果:SE-P在体外对肿瘤细胞U937、95D、SGC-27901和TE-1具有较强的抑制作用,IC50分别为117.42μg/mL、138.92μg/mL、37.76μg/mL和67.89μg/mL。除95D细胞外,SE2P对其他3株肿瘤细胞的最高抑制率均高于ME-P和RE-P。结论:蜂胶的超临界CO₂萃取物(SE-P)对体外培养的肿瘤细胞有较强的生长抑制作用。

高寅飞,马海乐,王振斌,王文兵

(1.江苏大学生物与环境工程学院食品系,镇江 212013;  2. 江苏省农产品生物加工与分离工程技术研究中心,镇江212013)

[关键词] 药物筛选试验,抗肿瘤;蜂胶;体外;肿瘤细胞

蜂胶(propolis)的英文名称源于希腊字pro(前方入口处)和polis(群落或城市),它是一种树脂类的天然产物。蜂胶富含黄酮类、萜烯类等生物活性物质,具有多重医疗及保健功效,如抗菌、消炎、抑制病毒、抗肿瘤、增强机体免疫力。近年来蜂胶的抗肿瘤作用,成为各国科学家和医学家研究的热点。

超临界流体萃取技术,是1985年以来国际上迅速发展起来的化工萃取分离技术,其萃取物以“无毒、无害、安全”而倍受瞩目。与传统的有机溶剂提取蜂胶相比,采用超临界CO₂萃取技术萃取的蜂胶,色泽呈鲜明的金黄色,保持了蜂胶浓郁的天然香味,其有效成分不被氧化和破坏,重金属含量远低于国家标准。

目前,对蜂胶抗肿瘤功效的研究集中于乙醇浸提物或水提物的活性组分。仅有少部分关于蜂胶的超临界CO₂萃取物的抗肿瘤研究。如Kimoto等在小鼠体内的抑瘤实验发现低剂量的蜂胶超临界CO₂萃取物可以作为治疗乳腺癌的良好药物。

本研究以MTT法研究3种不同类型蜂胶提取物的体外抗肿瘤活性,为充分开发利用蜂胶资源,寻找高效抗肿瘤成分提供参考。

1 材料与方法

1.1 仪器和试剂

仪器:CO₂培养箱,Heraeus公司;酶标仪(EL-340),Bioteck公司;96孔培养板,Cor-ning公司;倒置显微镜,Olympus公司。试剂:四甲基偶氮唑(MTT),Sigma公司;DMEM低糖培养基,Gibco公司;新生小牛血清,杭州四季青公司;胰蛋白酶、氨苄青霉素钠及硫酸链霉素,Amresco公司。二甲基亚砜(DMSO)购于上海化学试剂公司。以上试剂均为分析纯。

1.2 实验细胞株

肿瘤细胞系:U937(人白血病细胞株)、95D(猪肺癌细胞株)、SGC-7901(人胃癌细胞株)和TE-1(人食管癌细胞株),均为中国科学院上海药物研究所肿瘤细胞库引进并长期传代培养。用DMEM培养液,内含10%小牛血清,1×10⁵U/L青霉素和125mg/L链霉素,常规传代,置37℃、5%CO₂培养箱中培养,取对数生长期的各细胞株进行实验。

1.3材料

蜂胶的超临界CO₂萃取物(SE2P):由江苏江大源生态生物科技有限公司提供。蜂胶超临界CO₂萃余物的乙醇提取物(RE-P):将超临界CO₂萃取蜂胶萃取后的残渣经95%乙醇提取后浓缩得到的粗提物。蜂胶的乙醇提取物(ME-P):市售某品牌蜂胶。

1.4 MTT法

用丙酮做溶剂,临用前用DMEM培养液将上述3种类型的蜂胶提取物配成终浓度为200、100、50、25、12.5和6.25μg/mL的溶液,取对数生长期的U937、95D、SGC-7901及TE-1细胞,配制成1×10⁵个/mL的单细胞悬液,接种于96孔培养板中,每孔195μL,同时加5μL不同稀释度的含3种类型蜂胶提取物的丙酮溶液,培养液中丙酮的浓度不超过0.5%。阴性对照组用含0.5%丙酮的细胞悬液,空白对照为DMEM细胞悬液,每个稀释度设6个平行孔。置37℃、5%CO₂的培养箱中培养72h,实验终止前4h,每孔加入10μL 5mg/mL的MTT生理盐水溶液,继续培养4h,离心后弃上清液,每孔加入150μL的DMSO,充分振荡,待孔内结晶溶解后,用空白对照组调零,置于570nm波长的酶标仪测定光密度值D。按下列公式求出生长抑制率(inhibition rate, IR):IR(%)=(1-D₅₇₀/D₅₇₀′)×100%;式中:D₅₇₀为用药组的光密度值,D₅₇₀′为阴性对照组的光密度值。

1.5 统计学方法

数据经处理后,以SPSS10.0软件进行统计分析,两两比较采用q检验,以P<0.05认为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 3种蜂胶提取物对4株肿瘤细胞的生长抑制作用

如表1所示,SE-P、RE-P、ME-P对U937、95D、SGC-7901、TE-1细胞的生长均有一定的抑制作用。SE-P对这4株肿瘤细胞生长抑制作用随着浓度的增大而增强,呈良好的剂量2效应关系。SE-P在200μg/mL时,对4种肿瘤细胞的抑制作用达到最高,分别为78.23%、60.26%、67.56%、75.12%,且与RE-P和ME-P相比差异有统计学意义(P<0.05),提示SE-P有较强的细胞生长抑制作用。通过抑制率对药物浓度的直线回归方程,得到SE-P对U937、95D、SGC-7901、TE-1肿瘤细胞的半数抑制率(IC50)分别为117.42μg/mL、138.92μg/mL、37.76μg/mL和67.89μg/mL。

RE-P浓度小于100μg/mL和ME-P浓度小于50μg/mL时,两者对4株肿瘤细胞的抑制率也有较好的剂量2效应关系,且分别在100μg/mL和50μg/mL时对肿瘤细胞的抑制率达到峰值,提示RE-P和ME-P对肿瘤细胞的最适抑制浓度分别是100μg/mL和50μg/mL,超过此最适抑制浓度时,两者对肿瘤细胞的抑制效果均有减弱的趋势。

表1 3种蜂胶提取物对U937、95D、SGC-7901、TE-1细胞生长的抑制作用

2.2 丙酮溶剂的浓度对4株肿瘤细胞生长抑制作用的影响

由于SE-P的极性非常低,具有强亲脂性,难溶于水和甲醇,微溶于DMSO和N,N2二甲基酰胺(DMF),易溶于氯仿、乙醚和丙酮。实验以丙酮作为溶剂,发现培养液中丙酮浓度超过10%时,丙酮对U937、95D、SGC-7901和TE-1这4株肿瘤细胞生长有一定的抑制作用,但当浓度降低到2.5%时,其对上述细胞生长的影响极小。

3 讨 论

2000年以来,日本和中国相继成功地将超临界CO₂萃取技术应用于蜂胶的提取和分离,得到的金黄色提取物不含重金属且无有机溶剂残留,使蜂胶工业化达到了一个新的水平。蜂胶所含的组分十分复杂,目前已鉴定明确的物质就有三百多种。对蜂胶中抗肿瘤成分的研究集中在黄酮类化合物,如槲皮素、山奈素、高良姜素、芹菜素[;萜烯类化合物中的多种倍半萜、二萜类物质;酯类化合物如咖啡酸苯乙酯及其衍生物、异戊二烯酯及其衍生物等。不同类型的蜂胶提取物所含的抗肿瘤功效成分也有所区别。

本研究的主要结论如下:

(1)蜂胶3种提取物SE-P、ME-P和RE-P对4株肿瘤细胞U937、95D、SGC-7901和TE-1都有很好的抗肿瘤效果,表明蜂胶的3种不同类型的提取物均含有抗肿瘤活性物质。

(2)在实验参数范围内,SE-P对4株肿瘤细胞的抑制作用表现出良好的剂量2效应关系;RE-P和ME-P对4株肿瘤细胞的最适抑制率浓度分别为100μg/mL和50μg/mL。

(3)SE-P对U937、SGC-7901和TE-1的最高抑制率分别为78.23%、67.56%和75.12%,均高于RE-P和ME-P对该3株肿瘤细胞的最高抑制率;SE-P对95D的最高抑制率为60.26%,与RE-P的60.41%和ME-P的62.41%较接近。

(4)SE-P对U937、95D、SGC-7901和TE-1的IC50值分别为117.42μg/mL、138.92μg/mL、37.76μg/mL和67.89μg/mL。由IC50值可以看出,SE-P对SGC-7901和TE-1的抑制作用较U937和95D显著。