蜂胶二氧化碳超临界萃取物体外抗菌作用研究

【提要】目的：研究蜂胶二氧化碳超临界萃取物的体外抗菌作用。

方法：采用抑菌环试验和营养肉汤稀释法,对蜂胶二氧化碳超临界萃取物体外抗菌效果进行了实验室评价,同时与蜂胶醇提物作平行比较。

结果：蜂胶二氧化碳超临界萃取物对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌均有抑制作用,抑菌环直径分别为12mm和9.5mm;蜂胶醇提取物对两种细菌抑菌环分别为8.5mm和9.5mm。蜂胶二氧化碳超临界萃取物对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌最小抑菌浓度分别为14.5mg/ml和29mg/ml。而蜂胶CO₂超临界萃取残渣醇提物抑菌作用不明显。

结论：蜂胶二氧化碳超临界萃取物具有良好的抗菌作用,且其抗菌作用强于蜂胶乙醇提取物。

王 浩,李艳玲,高艳霞,辛晓明,刘宗昌,高允生(泰山医学院,山东泰安 271016)

关键词：蜂胶;二氧化碳萃取;乙醇提取物;抗菌作用

蜂胶(propolis)是蜜蜂从植物芽苞或树干上采集的树胶混入蜜蜂上颚腺分泌物和蜂蜡后加工制成的树脂状固态物质。蜂胶中含有的成分具有抗菌消炎、抗病毒、抗细菌、抗氧化等生物学活性及其他药效,极富药用价值[1-4]。目前,对于蜂胶活性的研究主要集中于醇提物和水提物。为提高蜂胶药效,降低其副作用,本研究采用二氧化碳超临界技术萃取蜂胶提取物,在实验室对其体外抗菌作用进行了研究,同时与蜂胶乙醇提取物作平行比较。

1 方法

1.1 蜂胶提取物制备方法

1.1.1 蜂胶二氧化碳超临界萃取物的制备

取蜂胶原胶去除其中的杂质、脱蜡。将脱蜡后的蜂胶冷冻粉碎,过200目筛,取100g投入到萃取釜中进行萃取工艺过程[5]。主要工艺参数为二氧化碳流量为50kg/h,萃取压力为30MPa,萃取温度为55°C,萃取时间为4h。投料每100g蜂胶,得萃取物15.8g。萃取物常温下为淡黄色脂状固体物,有浓郁的芳香气味。试验时,用体积分数30%乙醇将其配制成含量为464g/L溶液。

1.1.2 乙醇提取萃取残渣及除蜡蜂胶

将萃取残渣和除蜡蜂胶以1：10比例加入95%乙醇,于4°C冰箱静置过夜。次日将其超声提取30min,提取2次,合并滤液后旋转蒸发仪挥发乙醇得浸膏,分别为蜂胶醇提物和蜂胶萃取残渣醇提物,应用时以95%乙醇溶解备用。

>1.2 菌悬液的制备将大肠杆菌(8099)和金黄色葡萄球菌(ATCC6538)进行分离培养,得到单个菌落,取典型菌落接种营养肉汤培养成菌悬液。分别用无菌生理盐水将各菌悬液稀释配制成含菌数180cfu/ml的试验浓度菌悬液备用。

1.3 抑菌圈试验

将定性滤纸制成6mm直径的圆片,经过压力蒸汽灭菌处理,干燥保存备用。取处理好的滤纸片放入无菌平面皿内,每2层滤纸片滴加蜂胶二氧化碳超临界萃取物原液50ul如此再制作蜂胶乙醇提取物、蜂胶萃取残渣醇提物滤纸片,另取2层滤纸片滴加95%乙醇50ul作为对照,置无菌室晾干备用。用灭菌吸管吸取0.1ml各供试菌液加到事先准备好的普通营养琼脂平板上,涂布均匀。将上述纸片分别贴放于染菌琼脂平板表面,置37#恒温培养箱培养24h,观察结果,测量抑菌环直径。试验重复6次。

1.4 最小抑菌浓度(MIC)测定

将蜂胶二氧化碳超临界萃取物原液用30%乙醇作倍比稀释成不同稀释度的萃取物药液。分别取各稀释度药液2.5ml加入到装有2.5ml双倍浓度营养肉汤的试管中,另取30%乙醇2.5ml加入到装有2.5ml双倍浓度营养肉汤的试管中作为对照组。然后在每管中加入0.1ml试验菌悬液混匀,在不含药液的营养肉汤试管中加入0.1ml菌悬液作为阳性对照组。将各接种管置于37#培养箱中培养24h,观察结果。结果判定,在阳性对照管有菌生长和阴性对照管无菌生长的条件下,以试验组管无菌生长的最低稀释度为MIC值。试验重复3次。

2 结果

2.1 抑菌环试验结果

经检测,蜂胶二氧化碳超临界萃取物对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌均有抑制作用,抑菌环直径分别为12mm和9.5mm;蜂胶乙醇提取物对两种细菌抑菌环分别为8.5mm和9.5mm,萃取残渣乙醇提取物无抑菌作用。95%乙醇对照组对金黄色葡萄球菌抑菌环仅6.7mm,对大肠杆菌无抑菌作用(表1)。

2.2 最小抑菌浓度测定结果

经检测,蜂胶二氧化碳超临界萃取物对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的的MIC值分别为14.5mg/ml和29mg/ml(表2)

3  讨 论

二氧化碳超临界流体萃取是利用超临界流体的特殊性能进行化学物质分离的一种高新技术,其萃取物以“无毒、无害、安全”而倍受瞩目[6]。上世纪80年代开始将此项技术应用于蜂胶的提取。目前研究发现,蜂胶二氧化碳超临界萃取物同样具有多种生物学活性和相关的安全性。马海乐等研究表明,蜂胶二氧化碳超临界萃取物对体外培养的肿瘤细胞具有明显的抑制作用[7]。赵强等研究认为,二氧化碳超临界萃取的蜂胶挥发油具有明显的抗氧化作用[4]。本实验发现,蜂胶二氧化碳超临界萃取物能明显抑制金黄色葡萄球菌及大肠杆菌的生长,且其抗菌活性明显优于蜂胶乙醇提取物,而蜂胶萃取物残渣醇提物几乎无抑菌作用。研究结果提示,通过二氧化碳超临界萃取技术提取出的蜂胶活性成分会明显增强其抗菌效果,在抗菌方面会有更广泛的应用前景。但对于蜂胶二氧化碳超临界萃取物对其他细菌的作用以及其抗菌成分有待于进一步研究。

参考文献：

[1] 王玉芬.蜂胶的研究进展[J].河北医药,2002,24(3):227.

[2] 胡福良,玄红专.蜂胶的生物学活性及毒性和过敏反应[J].科技通报,2003,19(2):166.

[3] 王嘉军,刘敏霞,王全立,等.蜂胶-银离子符合纳米乳剂的研究及其杀菌活性评价[J].中国消毒学杂志,2006,23(4):289.

[4] 兰桃芳,孟良玉,白凤翎,等.蜂胶提取液的抑菌作用研究[J].食品科学,2006,27(12):224.

[5] 赵强,张彬,李岂凡,等.蜂胶挥发油抗氧化性能及其成分研究[J].天然产物研究与开发,2008,20(1):82.

[6] 吴家森,黄玉书.超临界流体技术及其设备与蜂产品加工[J].养蜂科技2003,21(1):38.

[7] 马海乐,毛丽琴,高寅飞,等.蜂胶超临界CO₂萃取物的体外抑瘤[J].江苏大学学报(自然科学版),2008,29(1):5.