蜂胶的抗病原微生物作用

摘要：蜂胶的抗病原微生物作用是蜂胶最重要的生物学活性之一。不同提取方法得到的蜂胶提取物都有显著的抗病原微生物作用，包括抗细菌、真菌、寄生虫、病毒。对近十多年来蜂胶醇提物(EEP)、蜂胶水提物(WEP)和其他类型蜂胶提取物的抗病原微生物作用的相关研究进展进行综述，以期为蜂胶抗病原微生物活性的进一步研究以及开发利用提供参考.。

关键词：蜂胶；蜂胶醇提物(EEP);蜂胶水提物(WEP);抗病原微生物作用

蜂胶抗病原微生物活性的应用最早可以追溯到古埃及时代。受蜜蜂使用蜂胶与蜂蜡包裹入侵者尸体的启发，古埃及人很早便学会将蜂胶作为一种防腐材料加以应用。而对于蜂胶抗菌活性的系统性研究最早开始于20世纪40年代[1]。近十多年来，随着人们对蜂胶关注度的逐渐升高，大量围绕蜂胶抗病原微生物活性的相关研究也随之展开。

１ 蜂胶醇提物(EEP)的抗病原微生物作用

乙醇是目前蜂胶提取最常用的溶剂，成本低，提取率高，且提取物的抗菌效果好，因此蜂胶抗菌研究中以蜂胶乙醇提取物（Ethanol extract of Propolis,EEP）最为常见。国内外大量研究表明，尽管蜂胶的来源不同，但EEP的抗菌活性相似，且抗菌范围非常广泛，除了一些常见的革兰氏阳性及阴性菌，EEP对牙周致病菌甚至某些抗生素耐药菌都有良好的抗菌效果，对真菌、寄生虫、病毒等也有一定的抑制作用。

1.1 抗细菌作用

陈荷凤等[2]比较研究了不同溶剂蜂胶提取物对金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、大肠杆菌（Escherichia coli）及绿脓杆菌（Pseudomonas aerμginosa）等７种常见菌的抗菌效果，结果发现，95%乙醇提取物抗菌效果最好，其次是60%乙醇、乙醚、乙酸乙酯提取物，而30％乙醇、蒸馏水、1％氢氧化钠溶液和5％碳酸氢钠溶液提取的蜂胶抗菌效果最差。这不仅表明了EEP具有良好的抗菌效果，同时也表明了EEP的抗菌效果与乙醇浓度有关。Koo等[3]研究了巴西东北部一种新型意蜂蜂胶以及巴西东南部和南部的蜂胶对变形链球菌（Streptococcus mutans）生长、黏附及对其水不溶性葡聚糖合成的影响。结果表明，这几种EEP都表现出抗变形链球菌的活性，对变形链球菌的最小抑菌浓度(MIC)为50~400ug/ml，对远缘链球菌（Streptococcus sobrinus）及仓鼠链球菌（Streptococcus cricetus ）的MIC为25-400ug/ml，最小杀菌浓度(MBC)是最小抑菌浓度的4-8倍；变形链球菌、远缘链球菌细胞的黏附和水不溶性葡聚糖的合成被EEP显著抑制；东北部新型蜂胶对细胞黏附和水不溶葡聚糖合成的抑制达到80％时，浓度最低可分别至12.5μg/ml和7.8μg/ml；高效液相色谱法(HPLC)分析结果显示，这种新型蜂胶的化学组分与巴西东南部和南部的蜂胶完全不同，既未检测到黄酮苷元也未检测到P-香豆酸，说明蜂胶的抗菌活性并不仅仅取决于黄酮类和羟基肉桂酸类物质。Uzel等[4]评估了产自土耳其安纳托利亚4种不同的EEP对包括口腔病原菌在内的不同微生物组的抗菌活性，并比较了它们的化学成分。宏量稀释法测定MIC结果表明，效果最好的EEP对远缘链球菌和粪球球菌（Enterococcusfaecalis）的MIC值为2μg/ml，对滕黄微球菌（Micrococcus Luteus）、白色念珠菌（Candida Albicans）、克鲁斯假丝酵母（C.krusei）的MIC值为4μg/ml，对变形链球菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌（Staphylococcus Epidermidis）和产气肠杆菌（Enterobacter aerogenes）的MIC值为8μg/ml，对大肠杆菌和热带念珠菌（C tropicalis）的MIC值为16μg/ml，对鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella typhimurium）和绿脓杆菌的MIC值为32μg/ml。HPLC结合质谱分析蜂胶的化学成分发现，安纳托利亚蜂胶最主要的化学成分是黄酮，如松属素、槲皮素、短叶松素等。Najmadeen和Kakamand[5]研究了产自伊拉克库德斯坦苏莱曼尼亚省几个不同地区的EEP(28%)对金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、大肠杆菌、绿脓杆菌、克雷伯氏肺炎菌（Klebsiella pneumoniae）、奇异变形杆菌（Proteus Mirabilis）和白色念珠菌的抑制作用。抑菌圈结果显示，EEP的抑菌效果甚至强于某些抗生素；对EEP最敏感的细菌是表皮葡萄球菌，接着是金黄色葡萄球菌和白色念珠菌，受试的革兰氏阴性菌最不敏感；MIC和MBC测定结果表明，金黄色葡萄球菌最敏ga感（0.175~0.700mg/ml），其次是表皮葡萄球菌和白色念珠菌（0.7~1.4mg/ml），在受试的革兰氏阴性菌中，所有的EEP样品都显示出对奇异变形杆菌较强的抑制活性（14mg/ml），而只有２个样品对绿脓杆菌和克雷伯氏肺炎菌有比较弱的活性（28mg/ml）。Zeighampour等[6]研究了伊朗伊斯法罕蜂胶70％乙醇提取物的抗菌活性，结果表明，该EEP对金黄色葡萄球菌的抗菌活性远高于绿脓杆菌，其MIC和MBC值分别为0.0143和0.0286mg/ml，对绿脓杆菌的MIC和MBC值分别为0.75、1.50mg/ml。

Gebara等[7]研究了蜂胶对牙周致病菌的抗菌活性，受试菌为中间普雷沃菌（Prevotella intermedia）、产黑色普雷沃菌（P. melaninogenica）、牙龈卟啉单胞菌（Porphyromonas gingivalis）、伴放线菌放线杆菌（Actinobacillus actinomycetemcomitans）、牙龈二氧化碳嗜纤维菌（Capnocytophaga gingivalis）和具核梭杆菌（Fusobacterium nucleatum）。肉汤稀释法结果表明，蜂胶对伴放线菌放线杆菌和牙龈二氧化碳嗜纤维菌的MIC为1μg/ml，对中间普雷沃菌、产黑色普雷沃菌、牙龈卟啉单胞菌和具核梭杆菌的MIC为0.25μg/ml，白色念珠菌的MIC为12μg/ml，绿脓杆菌、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌（野生型）的MIC为14μg/ml。熊萍等[8]研究了云南产EEP对牙周致病菌牙龈卟啉单胞菌(Pg)、具核梭杆菌(Fn)和伴放线放线杆菌(Aa)的抑制作用。结果表明，EEP对３种细菌都有抑制作用，随着浓度的增加，抑菌圈直径也随之增大。EEP对Pg、Fn和Aa的MIC分别为0.625、1.25、2.5g/100ml。

Kilic等[9]研究了土耳其蜂胶对一些常见的革兰氏阳性球菌的抗菌活性，将来自两个地区的３个样品制成EEP,研究其抗菌活性。受试菌为临床分离得到的33个耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌(MRSA)和33个耐万古霉素的屎肠球菌(VREF)。宏量稀释法结果表明，这3个EEP对MRSA和VREF的MIC分别为7.8~31.2μg/ml、70.3~281.2μg/ml和17.5~140.4μg/ml;所有的蜂胶对ＭＲＳＡ的活性都要强于对ＶＲＥＦ的活性。

Ozturk等[10]利用瘤胃模拟技术研究了不同浓度EEP对瘤胃微生物发酵的影响。结果表明，低浓度(20%)和高浓度(60%)的EEP都不影响瘤胃pH、短链脂肪酸及乙酸盐的产生和合适的比例，也不影响总的原生动物数和干物质消化率；高浓度的EEP会显著降低丙酸的产生，而高低浓度的EEP均能显著降低丁酸生成量，显著降低瘤胃细菌总数。此外，瘤胃液中的NH3-N浓度也呈浓度依赖的方式在低浓度和高浓度EEP的作用下分别降低了24%和39%。这表明蜂胶有可能成为一种有效的饲料添加剂，用于调节瘤胃微生物发酵，降低瘤胃氨的产生，提高氮的利用率。

1.2 抗真菌作用

Ota等[11]研究了蜂胶对不同种假丝酵母的抗真菌活性，结果发现所有受试真菌对EEP都敏感，敏感顺序为：白色念珠菌(Candida albicans)>热带念珠菌(C. tropicalis)>克柔假丝酵母菌（C.krusei）＞吉利蒙念珠菌(C.guilliermondii )。同时，体内试验结果也表明蜂胶能显著降低假丝酵母的数目。杨鑫等[12]对产自云南西双版纳的蜂胶原料进行75%、85%、95%乙醇常温浸提和热浸提，测定这些EEP的黄酮含量，并评估了EEP对杏鲍菇（Pleurotus eryngii ）及污染菌的抑制作用。结果表明，75%的乙醇热提法提取的EEP黄酮含量最高，为10.51mg/mL;EEP对杏鲍菇及污染菌均有一定的抑制作用，抑制强弱为：细菌＞杏鲍菇＞霉菌；相关性分析表明，杏鲍菇、霉菌和细菌的抑制率与黄酮含量的相关系数均大于0.8，有较强的相关性。

1.3 抗寄生虫作用

巴西学者[13]对产自巴西的EEP和产自保加利亚的EEP的成分及抗利什曼原虫（Leishmania spp）活性进行分析评估，结果发现EEP对4种不同的利什曼原虫的半抑制浓度(IC50)在2.8~229.3μg/ml之间,并且保加利亚EEP活性要强于巴西EEP,这可能与保加利亚蜂胶中丰富的黄酮类化合物有关，但巴西EEP抗巴西利什曼原虫（L. braziliensis）的活性是保加利亚EEP的3倍，这表明除黄酮以外的其他酚类成分可能参与了蜂胶的抗利什曼原虫活性。此外，巴西EEP中的香树脂醇也可能是其中发挥作用的重要成分。Ayres等[14]评估了巴西4个不同地理来源的EEP的抗亚马逊利什曼原虫（L. amazonensis）活性。结果表明，所有蜂胶样本均能降低感染的巨噬细胞数量及胞内寄生虫载量，其中来自阿拉戈斯州的红蜂胶提取物活性最强，其中包含异戊烯基及苯丙酮物质。Pon-tin等[15]首次报道了巴西绿蜂胶的体内抗利什曼原虫活性，表明无论是局部应用还是口服治疗都能显著抑制病变的发展，而且口服加局部应用效果更好。还有研究表明，产自土耳其亚纳达的EEP也具有抗利什曼原虫活性，当浓度在250、500、750μg/ml时能显著抑制热带利什曼原虫的增殖[16]。

Dantas等[17]研究发现保加利亚EEP及丙酮提取物具有抗克氏锥虫（Trypanoma cruzi）活性。保加利亚EEP作用于感染了克氏锥虫的骨骼肌细胞，使克氏锥虫无鞭毛体对细胞的感染及其在胞内的增殖减少。超微结构显示，提取物作用的靶点是前鞭体的线粒体及储备结合囊；此外，保加利亚EEP还能引起锥鞭体的动基体结构变化，表明线粒体动基体复合体也是EEP的潜在靶标。Gressler等[18]首次研究了巴西蜂胶抗伊氏锥虫的效果。体外实验结果表明，巴西蜂胶具有剂量依赖性杀锥虫活性,10μg/ml的蜂胶提取物作用1h后就能将全部锥鞭体杀死；然而将蜂胶分别以100、200、300、400mg/ml的浓度连续10d经口给药予感染鼠，并没有显示出疗效，但是高剂量组能够延长感染鼠的寿命，表明蜂胶也许可以辅助治疗伊氏锥虫感染性疾病。

Freitasa等[19]研究了EEP在体外对十二指肠贾第虫滋养体生长和黏附的效果。结果表明，当蜂胶浓度为125、250、500μg/ml时，蜂胶对寄生虫生长的抑制最明显。当蜂胶的浓度为125μg/ml时,抑制率达到50%，而且蜂胶还能抑制寄生虫的黏附；光学显微镜观察结果表明，蜂胶作用后，大多数滋养体的形态有所变化，且鞭毛摆动频率降低。

1.4 抗病毒作用

关于EEP抗病毒活性相关的研究也早有报道。Harish等[20]通过研究表明蜂胶具有抗人类1型免疫缺陷病毒(HIV-1)的效果,能够显著抑制HIV-1在细胞内的复制。Gekker等[21]的研究进一步证实了这一结论。他们利用培养的CD4+淋巴细胞和小胶质细胞研究了不同地区EEP抗HIV-1的活性。结果表明，蜂胶能有效抑制病毒在细胞内的表达，蜂胶作用浓度为66.6μg/mL时,对HIV-1在CD4+淋巴细胞和小胶质细胞内的表达抑制率最大，可分别达到85%和98%,并且这种作用具有浓度依赖性；不同来源的蜂胶表现出相似的抗病毒活性。此外，当把蜂胶和抗艾滋药物联合使用时，结果显示蜂胶与齐多夫定（Zidovudiner，反转录酶抑制剂）具有明显的协同作用，但对茚地那韦（Indinavir，蛋白酶抑制剂）的协同作用表现不明显。

Shimizu等[22]首次研究发现了蜂胶的体内抗流感活性。他们对产自巴西南部13个EEP的体内和体外抗流感活性进行了评估，经过体外的空白形成减少实验，筛选出了4种具有抗流感活性的提取物，并且通过鼠流感感染模型对这4种提取物的体内抗流感活性进行了进一步评估。结果表明，其中只有一种提取物在10mg/kg口服剂量时,能显著降低感染小鼠的体重损失;2mg/kg和10mg/kg的剂量还能有效延长感染鼠的寿命;10mg/kg剂量的EEP能显著减少感染鼠支气管肺泡灌洗液中的病毒量。然而，通过对感染鼠免疫相关的一些细胞因子水平检测发现，它们并没有发生变化，表明这种蜂胶可能本身就含有一些抗流感成分，并非是通过激活宿主免疫来发挥其抗流感作用。

2 蜂胶水提物(WEP)的抗病原微生物作用

相对于蜂胶醇提物，蜂胶水提取物（water extract of propolis WEP）的抗病原微生物作用报道较少。张红梅等[23]采用琼脂稀释法测定WEP对中间普氏菌（Prevotella intermedia）、具核梭杆菌（Fusobacterium nucleatum）及二者混合菌的MBC。结果表明，WEP对中间普氏菌、具核梭杆菌及二者的混合菌的MBC分别为0.025%、0.025%和0.05%,表明蜂胶对感染根管常见优势厌氧菌具有良好的抑菌活性。彭志庆等[24]研究了中国产WEP对变形链球菌、远缘链球菌及其耐氟菌株的生长抑制作用以及对葡糖基转移酶(GTF)的影响。结果表明,WEP对变形链球菌、变形链球菌耐氟菌株、远缘链球菌、远缘链球菌耐氟菌株的MIC分别为0.39、0.78、0.20、0.39g/L,MBC分别为0.78、1.56、1.56和1.56g/L;随着蜂胶浓度增高，GTF活性逐渐降低，表明中国产WEP能有效抑制变形链球菌、远缘链球菌及耐氟菌株的生长，对GTF具有较强的抑制作用。

此外，人们对WEP及其组分的抗病毒、抗寄生虫活性也进行了研究。Takemura等[25]研究发现，巴西WEP中的二咖啡酰奎宁酸能通过增强感染甲型流感病毒小鼠体内的肿瘤坏死因子相关的凋亡，诱导配体(TRAIL)的表达，促进被感染细胞的凋亡和病毒的清除，从而发挥体内抗流感病毒活性，并且这种作用比WEP本身的作用更强。Ferreira等[26]通过体内试验发现，巴西WEP能降低感染鼠肝脏中的寄生虫载量，并减轻感染鼠肝脾的病变。

3 其他类型蜂胶提取物的抗病原微生物作用

赵强等[27]以8种细菌作为受试菌研究了蜂胶超临界CO₂萃取物的抑菌作用，结果表明，超临界CO₂蜂胶萃取物对8种受试菌种有良好的抑制作用,MIC为78.1~2500ug/ml;超临界CO₂蜂胶萃取物的抑菌活性较EEP(25mg/ml)更强,MIC总体相当,但大大强于WEP。王浩等[28]也研究了蜂胶超临界CO₂萃取物的抗菌活性，并与其醇提物的抗菌活性作了对比。结果表明，蜂胶超临界CO₂萃取物对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的MIC分别为14.5、29mg/ml,并且抗菌活性强于其醇提物的抗菌活性。

此外，通过水蒸气蒸馏法、溶剂法、微波辅助提取等获得的蜂胶挥发性成分也有较好的抗菌活性。Melliou等[29]利用水蒸气蒸馏法将希腊５个不同地区蜂胶的挥发性成分进行提取，并对其抗菌活性进行了研究。结果表明，这几种挥发性成分具有良好的抗真菌效果，最强样品对白色念珠菌、热带假丝酵母、光滑念珠菌等3种真菌的MIC为0.50~5.20mg/mL。此外，该样品对阴沟肠杆菌（E.cloacae）和大肠杆菌的抗菌效果也最好，其MIC分别为3.10和3.40mg/mL。另一种样品对金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、绿脓假单胞菌和肺炎克雷伯氏菌的抗菌效果最好，其MIC范围为4.10~5.30mg/mL。

李雅晶[30]对利用微波辅助石油醚提取法提取的巴西蜂胶和中国蜂胶挥发性成分的抗菌效果进行了研究，结果表明这两种蜂胶的挥发性成分对酵母菌、霉菌及革兰氏阳性菌有较强的抑菌效果，对革兰氏阴性菌的抑菌效果相对较弱，抑菌浓度范围在39.06~625.00μg/mL;结果还发现，这两种蜂胶的醇提物对大肠杆菌均无抑制效果，而对绿脓杆菌只有中国蜂胶醇提物有较弱的作用；并且，这两种蜂胶挥发性组分的抗菌活性要强于其相应的乙醇提取物的抗菌活性。卢媛媛[31]利用优化的微波辅助石油醚提取法对巴西蜂胶残渣中的挥发性组分进行提取，并对巴西蜂胶原胶挥发性组分、残渣挥发性组分和乙醇提取物三者的抗菌活性进行了比较研究。结果表明，三者对金黄色葡萄球菌有明显的抑制效果，而对大肠杆菌则无明显抑制效果，且这三者抑菌活性的顺序为依次减弱。由此可见，蜂胶中的挥发性成分具有良好的抗菌潜力，即便是工业生产中废弃的蜂胶残渣，仍有大量挥发性成分未被提取，其抗菌效果优越，这为蜂胶残渣的再利用提供了理论依据。

4 小结

随着抗生素的广泛应用，耐药性问题也日益突出，因此寻找具有抗菌活性的天然药物成分也变得越来越重要和紧迫。蜂胶这一经过大量实验研究证实具有良好抗菌活性的天然产物，同时还具有抗氧化、抗炎、抗肿瘤、调节免疫等广泛的生物学活性，其应用前景广阔。然而尽管其抗菌作用已经被大量的体外实验证明，而相关的体内实验则非常少。由于体外实验只能证明蜂胶对一些微生物直接的抑制和杀灭作用，体外实验筛选的抗菌药物可能会存在有效作用浓度超过机体承受的毒性范围，或经机体代谢为抗菌能力大幅下降甚至消失的中间代谢产物等问题。因此，要想将蜂胶最终开发为临床用药还需要开展大量的体内试验，观察其在蜂胶、微生物及宿主三者相互作用动态条件下的实际效果，综合评价其抗病原微生物能力，为其将来投入临床应用提供更确切的指导。

参考文献:（略）