蜂胶与杨树胶鉴别的研究概况

摘要：中国蜂胶的主要来源是杨属植物，近年来出现了以杨树胶冒充蜂胶的现象，严重影响了我国蜂胶行业的健康发展。该文对蜂胶与杨树胶鉴别的研究进展进行综述，为蜂胶质量控制及相关标准的制定提供参考。

张翠平1,杨茂森2,李诗怡1,刘 泊2,胡福良1

(1.浙江大学动物科学学院,浙江 杭州 310058;2.甘肃耐克特蜂产品有限公司,甘肃 天水741000

关键词：蜂胶；杨树胶；指纹图谱；水杨苷；叶绿素

蜂胶是一种自古以来就被广泛应用的天然药物，应用历史悠久，是最早收载于《神农本草经》中的“露蜂房”的主要成分之一[1]，也载于《中华本草》，并且已被收录到《中华人民共和国药典》。蜂胶具有抗菌、抗炎、抗氧化、降血糖、抗肿瘤等广泛的生物学作用[2-5]，广泛应用于医药、保健食品、化妆品等多个领域。

由于蜂胶生产受胶源植物、蜂种、采胶方式、气候条件以及生产过程等多种因素的影响，产量相对有限。温带地区公认的蜂胶植物来源是杨属(Populus)及其杂交属的芽苞分泌物[6]。曹炜等[7]采用液相色谱及电喷雾质谱法对国内30个不同地区采集的蜂胶和2个地区采集的杨树芽的乙醇提取物进行液质联用分析，发现蜂胶与杨树芽提取物的谱图十分相似。由于蜂胶原料紧俏而利益较大，不法厂家用杨树芽熬制出杨树胶掺入到蜂胶中或直接以杨树胶冒充蜂胶，并加入类黄酮类物质，人为地提升总黄酮含量以达到以次充好的目的。

蜂胶与杨树胶的植物来源均为杨属，近年来二者的对比研究成为蜂胶质量控制研究的热点。研究者尝试通过液相色谱法、气相色谱质谱法、红外光谱法、热分析法等现代分析分离技术以及蜂胶与杨树胶的化学成分对比研究等多种方法来鉴别蜂胶与杨树胶。

１ 液相色谱法

潘建国等[8]采用液相色谱法在蜂胶中检测到10-羟基-2-癸烯酸(10-HDA),含量大约为0.22%。10-HDA是由蜜蜂上颚腺和咽下腺分泌的一种蜂王浆中所特有的高效生物活性物质，蜜蜂有可能在采胶的过程中加入了该物质。然而他们仅测定了3个样本，是否所有蜂胶中都含有10-HDA,含量多少等都有待进一步研究。盛文胜等[9]用液相色谱法对蜂胶与杨树胶中肉桂酸含量进行研究，发现真假蜂胶中肉桂酸的含量存在差异。但是由于不同地区采集的蜂胶即使同一成分含量差异也较大，对此还要进行大量取样才能确定其可行性。

液相色谱指纹图谱近年在蜂胶与杨树胶鉴别方面发挥了很大作用。周萍等[10]测定了蜂胶、杨树胶和掺假蜂胶的HPLC指纹图谱，发现蜂胶含有2个杨树胶不含有的特征峰，杨树胶中含有1个蜂胶中不含有的特征峰。他们对不同产地来源的62个蜂胶样品建立了HPLC指纹图谱，将蜂胶图谱分为六个区域，提出了以第四区的1号峰、2号峰、5号峰为蜂胶鉴别的主要依据，结合6个区域的指纹图谱进行真伪鉴别[11]。在此基础上，他们还建立了区分蜂胶与杨树胶的HPLC指纹图谱，以对照模板为参照，通过《中药指纹图谱相似度计算软件》计算，对蜂胶、杨树胶、蜂胶中掺杨树胶、蜂胶中掺外源性黄酮类化合物、既非蜂胶又非杨树胶等样品的相似度范围进行了限定[12]。该方法可以鉴别出杨树胶掺假量40％以上的样品。

张翠平等[13]采用HPLC建立了区分蜂胶与杨树胶的指纹图谱，发现8个不同地区蜂胶的HPLC指纹图谱十分相似，与杨树胶表现出完全不同的指纹图谱特征。其中，蜂胶中2个共有峰是杨树胶中没有的特征指纹峰，而3个不同来源的杨树胶中有5个共有峰是蜂胶中没有的特征指纹峰，且这5个特征峰明显，相互间没有干扰，易鉴别。王小平等[14]发现蜂胶与树胶主要化学成分基本相同，只是相对含量有所不同。他们建立了蜂胶指纹图谱分析方法，确定有13个共有峰，其中4个成分为已知成分；而10批真蜂胶中8号峰和10号共有峰的峰面积甚微，但在假蜂胶中这2个峰均较高，因此认为这2个峰的明显程度可以进行蜂胶与杨树胶的鉴别。但该方法样本量少，还需收集不同产地的大量样品进行系统规范研究。由于色谱指纹图谱以“整体性”和“模糊性”为特点，在没有具体指标成分参考条件下，不同检测条件下的图谱很难完全重复，给该方法的推广应用带来了一定的困难。

２ 气相色谱与质谱联用

蜂胶中含有大量的挥发性成分，因而有关蜂胶与杨树胶中挥发性成分的对比研究也较多。余兰平等[15]采用气相色谱-质谱联用方法研究发现蜂胶中芳香酸、醇及酯类物质的含量明显高于杨树胶，杨树胶中总黄酮和萜烯类化合物的含量略高于蜂胶。蜂胶和杨树胶中苯甲醇、3,4-二甲氧基肉桂酸、3-苯基-2,3-二甲基环丙烯、2,6-二羟基-4-甲氧基查耳酮和柯因的含量有比较大的差异，反油酸、1-(3-甲氧苯基)乙酮、4-乙酰基安息香酸苯基甲基酯只在蜂胶中存在并且含量在1%以上,4-羟基-3-甲基苯乙酮和佛手油烯在杨树胶中存在而在蜂胶中不存在。

程焕等[16]分别采用固相微萃取法(SPME)、动态顶空(DHS)对蜂胶和杨树树胶挥发性成分进行提取，经气相色谱—质谱联用(GC-MS)法结合计算机检索对其挥发性成分进行分析和鉴定，结果蜂胶中的酯类物质(乙酸-3-甲基-3-丁烯-1-醇酯、3-甲基-2-丁烯-1-醇甲酸酯、乙酸-3-甲基-3-丁烯-1-醇酯、3-甲基-2-丁烯酸-2-苯乙酯、壬酸乙酯、月桂酸乙酯、棕榈酸乙酯)、醇类物质(3-戊烯-2-醇、3-甲基-2-丁烯-1-醇、α-桉叶醇)、萜烯类物质(β-葎草烯、雪松烯)烯烃类物质八氢二甲基-2-(1-亚异丙基)萘在杨树胶中未检测到；而杨树胶中醇类物质(+/-)-α-红没药醇、烯烃类物质α-姜黄烯2,6,6,9-四甲基-三环[5.4.0.0(2,8)]-9-十一烯也未在蜂胶中检测到。

王向平等[17]以气相色谱－质谱联用仪分别对蜂胶和杨树胶的化学组分进行了分离鉴定，蜂胶中共鉴定出75种物质，杨树胶中共鉴定出71种化合物。蜂胶和杨树胶中的2,6-二羟基-4-甲氧基查耳酮、高良姜素和柚木柯因的含量有明显差异。3,4-二甲氧基肉桂酸、棕榈酸、1-二十六烷醇、1-十九烯只在蜂胶中存在并且含量均高于2%,愈创木醇、1-甲基-4-(6-甲基-5-庚烯-2-基)苯、2-苯基苯并咪唑在杨树胶中存在而在蜂胶中不存在。因此，可通过检测愈创木醇、1-甲基-4-(6-甲基-5-庚烯-2-基)苯、2-苯基苯并咪唑是否存在于蜂胶中来鉴别蜂胶中是否掺入了杨树胶，而通过检测2,6-二羟基-4-甲氧基查耳酮、柚木柯因和高良姜素的含量来确定蜂胶的真伪和掺假程度。

电子鼻是根据仿生学原理，由传感器阵列和自动化模式识别系统所组成，是一种新颖的分析、识别和检测复杂气味和大多数挥发性成分的仪器，已经用于食品行业中的等级划分与新鲜度检测。延莎[18]等用电子鼻对来自17个省份的71个蜂胶样品及其杨树胶进行测定。通过主成分分析，可以较好地区分蜂胶和杨树胶。董捷等[19]利用电子鼻对14个省市及掺假蜂胶共52个样品进行分析，通过电子鼻对蜂胶芳香特征的响应实验，可以得出电子鼻对蜂胶的芳香成分有明显的响应，并且每一个传感器对蜂胶的响应各不相同。应用电子鼻的几类传感器，针对几类特定的物质（而不是几种物质）进行分析，并对所得的结果应用主成分分析方法(PCA)进行处理，能够鉴别掺假蜂胶。但是在该研究试验中，也存在几个地区的蜂胶样品难以区分的情况。且该实验中并未取不同品种的蜂胶作对比，并不十分严密。所以对于利用电子鼻鉴别真假蜂胶的方法还有待进一步深入研究和完善。

延莎等[20]采用气质与嗅闻仪结合的方法，分析了3种蜂胶样品和杨树胶的气味活性成分，共鉴别出48种气味活性成分，包括酯类、醛类、醇类和酸类化合物。结果表明，形成蜂胶的气味活性成分中具有更多的花香、果香物质，如梨醇酯、糠醛、苯甲醛等化合物，使蜂胶具有更为清香、柔和的总体气味特征，而杨树胶呈现出的整体气味较蜂胶更为刺鼻、尖酸，可以考虑从气味特征上对蜂胶与杨树胶进行识别。

由于不同来源的蜂胶中挥发性成分差异较大，至今还未形成有效的基于蜂胶中挥发性成分的蜂胶与杨树胶鉴别方法。

３ 红外光谱法

Wu等[21]使用傅里叶变换红外光谱和二维红外光谱联用对不同地区蜂胶及杨树芽分泌物进行分析，发现它们之间具有相似的红外谱图。二者的差异在于长链烃基化合物的不同（包括长链烷烃，长链烷基酯，长链烷基醇）。蜂胶提取物比杨树芽提取物中长链烷基类化合物更多，这些化合物中碳原子呈Ｚ形排列，而杨树芽提取物中是不规则的。龚上佶[22]研究发现树胶与蜂胶的光谱图差异显著。所有蜂胶在基团频率区存在2个特征峰区域，分别是:2848.53～2849.08和2916.76～2917.74(为烷烃的特征峰)。而树胶在这2个区域不存在特征峰；树胶特征峰集中在1150～1300（为醇、酚及醋类的特征峰）和1550～1650（为亚硝基、酞胺及烯烃的特征峰）两个区域。而蜂胶在1800～4650间存在很多特征峰。这两方面的差异可用于区别蜂胶与树胶，并且可用于真假蜂胶的鉴别。由于红外光谱图具有整体性、特征性和模糊性的特点，可以作为复杂混合体系鉴别与质量监控的快速、有效的方法。红外光谱法是应用于蜂胶真伪鉴别较为可行的一个技术，但其实验结果受样品处理时的影响容易产生假象。

４ 热分析法

付阳等[23]采用热分析的方法对蜂胶和杨树胶的DSC-TG曲线的特征区间进行比对，结果发现他们的TG曲线分为两个阶段：第一阶段为100~300℃,为小分子的分解,蜂胶的失重率为47.72%,杨树胶的失重率为32.69%;第二阶段为340~700℃,为大分子的降解，蜂胶的失重率为47.29%,杨树胶的失重率为54.86%。而DSC曲线中,蜂胶在333.0℃有一个吸收峰，在503.0℃有一个放热峰。杨树胶在314℃有一个吸收峰,在478.0℃有一个放热峰。通过比较发现，在第一失重阶段，蜂胶的小分子有机物含量比杨树胶高15％，而第二阶段，蜂胶的失重较为缓慢，为黄酮类混合物的降解，杨树胶具有典型的高分子聚合物的特征。从两者的残碳率来看，蜂胶几乎为零，杨树胶为7.48％。但该方法并未形成有效的检测方法。

５ 以水杨苷为指标

杨属植物的特征性成分是酚苷，以水杨苷、柳皮苷、2’-苯甲酸水杨苷和特里杨苷含量较为丰富[24、25]。有关蜂胶化学成分的研究很多，迄今为止尚未有蜂胶中存在任何酚苷的报道，但很多研究曾报道过蜂胶中含有水杨酸及乙酰水杨酸等衍生物[26/27]。杨属植物中发现的酚苷均以β-葡萄糖苷形式连接，β-葡萄糖苷酶可催化水解结合于末端非还原性的β-D-糖苷键，同时释放出配基与葡萄糖体。张翠平等[28]在进行蜂胶中酶活性研究中首次在新鲜蜂胶的酶提取液中检测到β-葡萄糖苷酶活力，并证实该酶能够水解芳香基β-D-葡萄糖苷,与Pontoh等[29]从西方蜜蜂体内分离纯化的β-葡萄糖苷酶性质相符。因此，推测蜜蜂在采集蜂胶以及蜂巢内传递蜂胶的过程中已将酚苷水解。

杨属植物有100多种，主要分布在温带和亚热带地区。水杨苷是酚苷的基本结构单元，是更高级的水杨酸盐类衍生物的主要降解产物之一，在所有研究过的杨属植物的皮、叶、花，芽中均有分布[30]。张翠平等[31]用高效液相色谱法优化了杨树芽中水杨苷的测定方法，在蜂场周围分布较多的北京杨和加拿大白杨的叶子和芽中均检测到水杨苷存在；在随机购买的11个杨树胶样本中也均检测到水杨苷的存在；而在蜜蜂采集回蜂箱内5d、10d、15d、20d及30d的蜂胶样本中均未检测到水杨苷的存在。以上事实支持蜜蜂在采集加工蜂胶过程中已将水杨苷水解，而在杨树胶制作过程中水杨苷稳定存在，证明以水杨苷为参照鉴别蜂胶与杨树胶的可行性。除了水杨苷特征峰，还有一个峰Ａ在所有杨树胶样本中存在，而在蜂胶中不存在，该峰经鉴定为邻苯二酚[32]。它在所研究的杨属植物的芽、叶、花、皮中均有分布，其物理性质极其稳定，可在甲醇、酸性、碱性以及中性介质中均能稳定存在。在存在多酚氧化酶的条件下，可被氧化为1,2-苯醌，但其所需的氧化酶应具有较强的特异性，即可以氧化具有邻位二羟基的多酚类化合物。根据相关研究表明，蜜蜂中存在可以氧化邻苯二酚化合物的多酚类氧化酶，因此推测蜜蜂在采集蜂胶以及蜂巢内传递蜂胶的过程中，蜜蜂自身腺体分泌的多酚氧化酶将邻苯二酚大量氧化，从而使其在蜂胶中消失。从收集到的国内不同来源的蜂胶样本中均未检测到水杨苷或邻苯二酚，证实了以水杨苷或邻苯二酚为代表的液相色谱指纹图谱方法鉴别蜂胶与杨树胶是可行的。目前，以水杨苷为指标的蜂胶中杨树胶的鉴别方法已成为中华供销总社行业标准，而且即将纳入蜂胶国家标准，用以区分蜂胶与杨树胶，规范蜂胶行业的健康发展。

６ 以叶绿素为指标

周立东等[33]利用光谱法对比蜂胶与杨树叶、杨树芽中叶绿素含量的差别，发现测定的11个蜂胶样品中均不含叶绿素，杨树叶提取物中叶绿素含量较高，杨树芽50％乙醇提取物中含有叶绿素，但含量较低，杨树芽95％乙醇提取物中未能检出叶绿素，杨树胶中也未检测到叶绿素。该方法可以鉴别直接掺入杨树叶或杨树芽粉末的假蜂胶，以及各种含叶绿素杂质的掺假蜂胶。但不能排除其中掺有杨树芽高极性溶剂提取物的可能。杨茂森等[34]根据相似相溶原理，利用极性较低有机溶剂对蜂胶及杨树（芽）胶中叶绿素类物质进行溶解、分离萃取，通过分光光度法进行定量对比检测，发现蜂胶中叶绿素平均含量为6.73mg/100g,提纯杨树（芽）胶中叶绿素平均含量为111.2mg/100g,两种不同胶体叶绿素含量差异十分明显；在蜂胶中按不同比例掺入杨树（芽）胶进行回收检测试验，发现杨树（芽）胶掺入量与叶绿素的增加量成正比线性关系。利用叶绿素含量作为一种鉴定指标，整个鉴定过程变得更简单、更方便、更直观，但还需要更多的样本来探明蜂胶与杨树胶的叶绿素临界值。

参考文献:（略）