摘 要:口腔疾病是影响人体健康的常见病,大多是由于口腔中的致病菌引起的。本文通过测定超临界二氧化碳萃取的蜂胶提取物对4种口腔常见致病菌的最小抑菌浓度,证实其具有良好的抑菌性能。然后,将其应用于牙膏,对牙膏作抑菌环试验,结果显示该牙膏与空白牙膏相比抑菌效果有显著性差异,与阳性对照牙膏相比抑菌效果相当,即该牙膏具有良好的抑菌能力。
李毅苹 (广州 510410）
关键词:超临界二氧化碳萃取 蜂胶牙膏 抑菌性能
1 研究意义
口腔疾病是影响人体健康的常见病、多发病。常见的口腔疾病主要有龋病、牙龈炎、牙周病、口腔溃疡等。WHO把龋齿列为在世界范围内应重点防治的三大慢性非传染性疾病之一,排在心脑血管病和癌症之后的第三位。这表明慢性非传染性疾病对人群健康的危害性已引起人类的关注,口腔疾病的防治是未来生命科学研究的重要课题之一 [1] 。
大部分口腔疾病及口腔问题,主要是由于口腔中存在的致病菌引起的。口腔细菌摄取糖后所产生的酸能够导致蛀牙;由口腔细菌所产生的毒素,可导致牙龈出血;此外,这些细菌的代谢废物还可导致牙结石及口臭等。因此,控制口腔致病菌是预防口腔疾病的主要任务。
口腔疾病大多起病隐匿,早期症状不明显,常常被忽略或被错误判断为“上火”等其他问题。而且,国人对口腔保健的意识还比较薄弱,在口腔问题未发展到非常严重的程度之前,普遍不会太重视,不会去医院进行医治,而可能仅是自行吃一些抗生素或清火的药物,以缓解症状。
事实上,如果通过良好、有效的口腔清洁卫生习惯,可大大避免或减少口腔问题的发生。其中最简便、最直接的方法就是使用牙膏进行口腔清洁,清除口腔中有害的细菌,并控制其再生。
本研究选取超临界二氧化碳萃取的蜂胶提取物作为研究对象,研究其对4种口腔常见致病菌(牙龈卟啉单胞菌、变形链球菌、中间普氏菌、具核梭杆菌)的抑菌性能。并将其应用于牙膏,研究牙膏对口腔中致病菌的抑菌性能。
本研究希望通过在牙膏中添加超临界提取的蜂胶,研制出对口腔中的致病细菌具有良好抑制作用、能辅助改善口腔问题、维持口腔健康的牙膏。
2 蜂胶的成分及药理作用
蜂胶是由蜜蜂从植物幼芽、树皮与树干裂缝上采集来的树脂,并混入其上颚腺分泌物和蜂蜡等加工而成的具有芳香气味的胶状固体物 [2] 。蜂胶是 一种天然广谱抗菌剂,对病原真菌、细菌及病毒都有很强的抑制作用。蜂胶无毒无害,具有多种保健作用,因此是理想的天然抑菌剂 [3] 。
蜂胶的化学成分非常复杂,到目前为止在蜂胶中发现的化学成分已经超过200多种。其基本成分是:50%～55%的树脂类、芳香油,30%～40%蜂蜡,5%～10%的花粉[4]。其中分离出的类黄酮化合物、醇、醛、酚类物质构成蜂胶的香气,酸性物质和部分黄酮具有抗菌、消炎、防腐作用[5]。黄酮类化合物是蜂胶的主要生物活性成分。已从蜂胶中分离出来30多种黄酮类化合物,包括黄酮类、黄酮醇类和双氢黄酮类等。黄酮化合物在物界分布很广泛,含有很多活性化合物,具有重要作用,对多种疾病表现出良好的治疗作用,因而药用价值很高。
中医药文献中记载蜂胶有润肤生肌、解毒杀虫、祛风止痛以及治疗风虫牙痛等功效主治 [6] 。
2.1 抗菌作用
蜂胶及其制剂能抑制金黄色葡萄球菌、链球菌、沙门氏菌、大肠杆菌、绿脓杆菌、白色念珠菌和炭疽杆菌等20余种细菌。对主要致龋菌进行体外抑菌试验,有显著效果。另外,蜂胶还具有中和细菌毒素的作用,常用不会引起菌群失调症,也不会产生耐药现象 [7] 。
2.2 抗炎镇痛和抗溃疡作用
蜂胶具有消炎和促进组织愈合的功效。能促进口腔溃疡的愈合,促进组织修复。其化学成分中的花粉、多种维生素、脂肪酸、多糖有营养作用,可提供溃疡愈合所需的营养;醇类、酚类、醛类有腐蚀、凝固有机质、促进组织再生、溃疡愈合作用 [8] 。
2.3 镇静麻醉作用
能拮抗咖啡因引起的中枢兴奋作用。具有局部 麻醉作用,与普鲁卡因作用相似[6] 。其有效成分为芳香油和醚类 [9] 。
2.4 毒性作用
实际无毒、无刺激物质 [10] 。蜂胶无致癌性 [11] 。
3 蜂胶的提取方法比较
天然蜂胶中含有蜂蜡、蜂尸、木屑和泥沙等杂质,在使用前,要先进行去除杂质、提取精制。传统方法是用乙醇浸出提取,现代技术用CO2超临界萃取技术萃取。
醇提方法提取出来的蜂胶是黑褐色的,是能溶于酒精的黑色焦油状态的物质所致,这是多酚的一种咖啡酸聚合物,这种聚合体有难以入口的味道,在口中会有麻木感。另外,咖啡酸的诱导体是过敏原物质,在超临界提取的蜂胶里,不含有这种物质,可以防止过敏症发生。因此,醇提的蜂胶不适合用于牙膏,且对膏体的外观会有很大的影响。
超临界提取的蜂胶是金黄色的,是黄酮类物质的颜色。超临界提取的蜂胶没有溶剂残留。提取时所用的温度近于室温,不会破坏非耐热的酵素等。且沸点非常低的香味成分可以基本完全提出,因为所有香的成分是脂溶性的,完全溶解于二氧化碳。因此,超临界提取法是提取全部香味的最好方法,提取的蜂胶具有浓郁的蜂蜜特征香气。
用超临界提取法是在无氧状态下提取的,不会使提出的成分氧化。含有黄酮类的多酚化合物,有氧状态下,稍加热,就会被氧化而失去黄酮类的活性,颜色变深。不饱和脂肪酸氧化产生的过氧化碳脂化合物有毒性。
另外,采用超临界提取,微调压力和温度等,就能选择地提取需要的成分,提取的范围幅度大。能有效除去蜂胶中的重金属,如铅等,确保了产品的安全性。
4 超临界萃取蜂胶提取物的抑菌性能研究
4.1 最小抑菌浓度测定试验
4.1.1 原理
本试验采用琼脂稀释法将不同浓度的抑菌剂混合溶解在琼脂培养基中,然后点种细菌,通过细菌的生长与否,确定抗(抑)菌物质抑制受试菌生长的最低浓度,即最小抑菌浓度(MinimalInhibitoryConcen-tration,MIC)。本方法适用于不溶性抗(抑)菌产品。
4.1.2 试验材料
4.1.2.1 菌株
牙龈卟啉单胞菌(P.gingivalis)ATCC33277
变形链球菌(S.mutans)CNCC32400
中间普氏菌(Prevotellaintermedia)
ATCC25611具核梭杆菌(F.nucleatum)ATCC25586
4.1.2.2 抗(抑)菌物质
超临界二氧化碳萃取蜂胶提取物,广州美晨药业有限公司。 三氯生,河北卫洁日用化工厂。
4.1.3 试剂、器材及操作步骤
参照《消毒技术规范(2002年版)》2.1.8.3“最小抑菌浓度试验(琼脂稀释法)”。
4.1.4评判规定
菌落生长被完全抑制的最低抗(抑)菌液浓度为该样品对受试菌的MIC。单一菌落生长忽略不计。
4.2 实验结果与讨论
本研究选用的变形链球菌是公认的主要致龋菌,可引起牙齿任何部位的龋损;选用的牙龈卟啉单胞菌、中间普氏菌、具核梭杆菌是牙周炎的可疑致病菌,在牙周病的发病和病情进展中起重要作用。选这4种菌作为龋病、牙周病的代表菌。
4.2.1 蜂胶对4种口腔常见致病菌分别有不同的抑菌浓度,结果见表1。
4.2.2 三氯生对4种口腔常见致病菌分别有不同的抑菌浓度,结果见表2。
4.2.3 最小抑菌浓度 两种抑菌物质对口腔常见致病菌的最小抑菌浓度,结果见表3及图1。
4.3 结果分析
超临界二氧化碳萃取的蜂胶提取物,对4种口腔致病菌均有较好的抑制效果,尤其对中间普氏菌有很强的的抑制作用,与作为阳性参照的三氯生相当。
关于蜂胶抗菌作用机理,有学者 [12] 推测是某些 单一成分的作用,主要来自含量很高的黄酮类,可能是黄酮类和苯乙烯类成分分解了细菌胞膜上的能量,从而限制细菌运动。蜂胶可能含有抑制变链生长繁殖的生物活性物质,但也有研究 [13] 说明从蜂胶 中提出单一成分(如黄酮类化合物)的抗菌作用不如总提取物,故认为蜂胶的药用价值是它作为一种天然混合物表现出来的,其抗菌作用是所含各种成分综合作用的结果,单一成分不能作为高效抗菌制剂的来源。Takaisi等 [14] 利用微量测热法和电子显 微照相技术研究了蜂胶对链球菌的作用方式,结果表明,蜂胶可以通过抑制细胞分化抑制细菌生长,进而导致假性多细胞(Pseudo-multicellular)链球菌形成。此外,蜂胶还能破坏细胞膜和细胞浆的有序状态,引起部分溶菌和抑制细菌蛋白质合成 [15] 。由此推断,
蜂胶可能是通过影响细菌的繁殖和生长,而表现出较强的抑菌作用;可见蜂胶的抗菌机制十分复杂,是各种成分综合作用的结果,其确切作用机制还有待进一步研究探讨。
三氯生在本研究中作为阳性参照物,其对4种口腔常见致病菌的MIC均较小,体现出其具有良好的抑菌能力,与以往研究结果一致。
三氯生的抑菌能力可能由于其具有亲脂性,可直接作用于细菌的胞浆膜,抑制细菌对必需氨基酸的摄取 [16] ,从而达到抑菌的作用。 4.4 小结 虽然超临界萃取蜂胶的抑菌效果总体不及三氯生,但其来源天然、安全有效的特性对于牙膏这种口腔护理用品十分重要,因此,接下来对其在牙膏中的应用作研究。
5 抗菌物质在牙膏中的应用
5.1 牙膏基础配方的确定
经过分别以石粉、磷酸氢钙及二氧化硅为磨擦剂的膏体试验,结果显示,二氧化硅膏体稳定性良好,受活性物质影响的程度相对较小。而且二氧化硅比较惰性,其形成的膏体pH值接近中性,有利于 天然提取物的稳定。所以,选取以二氧化硅为基质的牙膏作为研究对象,配方见表4。
其中抗菌物质的添加量为:
蜂胶牙膏:分别添加超临界二氧化碳萃取蜂胶提取物0.1%、0.3%、0.5%;
三氯生牙膏:分别添加三氯生0.1%、0.3%。
5.2 蜂胶牙膏抑菌性能研究
蜂胶对4种口腔致病菌的最小抑菌浓度只代表单纯的抗菌物质对细菌的作用。但牙膏配方中组分复杂,抗菌物质添加到牙膏中是否还能发挥其抑菌效果,下面进一步探讨。
依据上述对抗菌物质抑菌性能的研究作为基础,对添加蜂胶的牙膏进行抑菌环试验,并设置空白牙膏作为阴性对照、添加三氯生的牙膏作为阳性对照,以确定牙膏对4种主要的口腔致病菌的抑制能力。
5.2.1 牙膏抑菌环试验
5.2.1.1 原理
利用抑菌剂不断溶解经琼脂扩散形成不同浓度梯度,以显示其抑菌作用。试验通过抑菌环大小以判断其是否具有抑菌能力。
5.2.1.2 试验菌株
牙龈卟啉单胞菌(ATCC33277)
菌悬液变形链球菌(CNCC32400)
菌悬液中间普氏菌(ATCC25611)
菌悬液具核梭杆菌(ATCC25586)菌悬液
5.2.1.3 实验牙膏 蜂胶牙膏、三氯生牙膏和空白牙膏(不含抗菌物质,其余成分一致)。
5.2.1.4 试验方法
(1)抑菌片的制备:采用牙膏与水1∶3稀释成均匀牙膏浆后,取无菌并干燥的滤纸片。每片滴加牙膏20μL,然后将滤纸片平放于清洁的无菌平皿内,开盖置温箱(37℃)中烤干,或置室温下自然干燥后备用。
(2)阴性对照样片的制备:取无抑菌活性成分或无显著抑菌效果的牙膏与水1∶3稀释成均匀牙膏浆后,取无菌并干燥的滤纸片。每片滴加牙膏20μL,然后将滤纸片平放于清洁的无菌平皿内,开盖置温箱(37℃)中烤干,或置室温下自然干燥后备用。
(3)试验菌的接种及抑菌剂样片贴放:参照《消毒技术规范(2002年版)》2.1.8.1“抗(抑)菌试验”。
(4)测量抑菌环时,应选均匀而完全无菌生长的抑菌环进行。测量其直径应以抑菌环外沿为界。
5.2.1.5 评价规定
(1)抑菌作用的判断
抑菌环直径大于7mm者,且试验组的抑菌环显著大于阴性对照组,判为有抑菌作用。抑菌环直径小于或等于7mm者,判为无抑菌作用。
(2)3次重复试验均有抑菌作用结果者,判为合格。
5.2.2 试验结果
(1)空白牙膏的抑菌试验结果表明,空白牙膏对4种口腔常见致病菌的抑菌环平均直径均不大于7mm,即其不具有抑菌作用。
(2)蜂胶牙膏对口腔常见致病菌抑制作用的实验结果见表5和图2。从表5抑菌环平均直径数据看,蜂胶添加量为0.1%的牙膏只对中间普氏菌有一定的抑制作用,添加量为0.3%和0.5%时,对4种口腔常见致病菌均有抑制作用。从图2可以看出,随着蜂胶添加量的增加,牙膏抑菌环直径扩大,即牙膏的抑菌性能增强。
(3)三氯生牙膏对口腔常见致病菌抑制作用的实验结果见表6和图3。从表6抑菌环平均直径数据看,三氯生添加量为0.1%和0.3%的牙膏对4种口腔常见致病菌均有抑制作用。从图3可以看出,随着三氯生添加量的增加,牙膏抑菌环直径扩大,即牙膏的抑菌性能增强。
5.2.3 结果讨论
通过采用一元回归方差分析,在α=0.05水平上:
(1)蜂胶添加量为0.1%的牙膏其抑菌环直径与空白牙膏比较没有显著性差异;而蜂胶添加量为0.3%及0.5%的牙膏其抑菌环直径与空白牙膏比较有显著性差异,说明该两个添加量下的蜂胶牙膏对口腔致病菌具有良好的抑菌功效;
(2)三氯生添加量为0.1%和0.3%的牙膏其抑菌环直径与空白牙膏比较有显著性差异,说明该两个添加量下的三氯生牙膏对口腔致病菌具有良好的抑菌功效;
(3)蜂胶添加量为0.1%的牙膏其抑菌环直径和三氯生添加量为0.1%比较,有显著性差异;蜂胶添加量为0.3%的牙膏其抑菌环直径和三氯生添加量为0.3%比较,没有显著性差异,说明该添加量下蜂胶牙膏和三氯生牙膏对口腔致病菌同样具有良好的抑菌效果。
5.2.4 小结
从上述数据分析可以看出,添加超临界二氧化碳萃取蜂胶的牙膏,在添加量为03.%及0.5%时明显优于空白对照样,且与阳性对照抑菌效果相当。表明蜂胶添加到牙膏后依然能发挥其对口腔致病菌的抑菌性能,所制出的牙膏对口腔致病菌具有良好的抑制作用。
6 结论与展望
本研究以我公司的高新分离技术作为平台,研究超临界二氧化碳萃取蜂胶的抑菌作用及其应用于牙膏的抑菌性能。超临界二氧化碳萃取物应用于牙膏在国内甚至国外研究目前均较少,此为研究的创新点之一。 超临界二氧化碳萃取蜂胶及其牙膏,对4种口腔常见致病菌均具有较好的抑制作用。 添加超临界二氧化碳萃取蜂胶的牙膏,能充分利用提取物的所具有的天然蜂蜜香气,令牙膏的口感更丰满、独特,这种口感非香精可以模拟。
本文暂时只在体外的基础上进行研究,但口腔是一个复杂的系统,要对抗菌牙膏对口腔致病菌的抑制作用有更准确的判断,需进一步开展临床试验。本研究为临床试验奠定了良好的基础、提供了有力的试验依据。 天然抗菌物质在牙膏中的应用有望可以取代合成抗菌剂的使用,令牙膏更“绿色”,可避免安全性方面的隐患,具有更广阔的应用前景。
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