不同方法萃取蜂胶挥发油组成及抑菌作用的研究

摘要：采用水蒸气蒸馏法和超临界二氧化碳萃取法获得了蜂胶挥发油。GC-MS分析并鉴定出50种化合物，两种提取方法所得蜂胶挥发油在成分组成上存在显著差异。抑菌实验表明，两种提取方法获得的挥发油对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌具有很强的抑制作用，而超临界法萃取的挥发油的抑菌效果强于水蒸气蒸馏法。

徐响  董捷  丁小宇  杨佳林  孙丽萍

(1.中国农业科学院蜜蜂研究所，北京 100093；2.农业部国家蜂产品加工专业分中心，北京 100093)

关键词：超临界二氧化碳萃取法；水蒸气蒸馏法；蜂胶；抑菌作用

蜂胶含有大量生物活性物质，包括黄酮类、酚酸类、醇类、萜烯类和甾醇类化合物等[1]，是具有良好保健功能的蜂产品，具有抗氧化、抗菌消炎、抗衰老、增强免疫力等活性[2-4]。蜂胶提取物以其良好的保健功能，成为一种非常有前途的功能食品，具有广阔的开发前景。目前国内关于蜂胶黄酮类化合物的研究较为广泛[5] ，而对于研究其挥发油提取方法的比较及其抑菌活 性的报道较少，仅赵强等[6]对蜂胶挥发油的抗氧化活性进行了评价。本研究比较传统的水蒸气蒸馏法与超临界二氧化碳萃取法得到的挥发油在组成和抑菌活性上的差异，为蜂胶产品的开发提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

蜂胶(为毛胶，采自安徽芜湖，胶源植物主要为杨树) 北京中蜜科技发展有限公司；乙醇 北京化学试剂有限公司；二氧化碳(纯度99.9%) 北京普莱克斯气体有限公司。

供试菌种：金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus，CICC编号10201)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis，CICC编号10063)、铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa，CICC编号20240) 中国微生物菌种保藏中心。

LB琼脂培养基 北京路桥试剂公司。

1.2 仪器与设备

1L超临界流体萃取装置(装置的流程图见文献[7]) 江苏南通华安；Agilent7890/5975气相质谱仪(GC-MS)Agilent公司；LRH-150型生化培养箱 上海一恒科学仪器有限公司；D-1型高压灭菌锅 北京发恩科贸有限公司；ZY-300IV型多功能抑菌圈分析仪 北京先驱威锋技术开发公司。

1.3 方法

1.3.1 超临界CO2萃取

将125g冷冻的蜂胶粉碎过20目筛，置于萃取釜中， 设定萃取温度40℃，分离条件：分离Ⅰ温度40℃，压力7MPa、分离Ⅱ温度20℃。从钢瓶中流出的CO2经净化后进入冷凝箱即液化器冷凝至流体，经高压计量泵加压至萃取压力30MPa后进入萃取釜进行动态萃取，CO2经减压阀进入分离釜，收集分离釜Ⅰ的萃取物，萃取物采用文献[6]的方法进行处理得到1.968g蜂胶挥发油。

1.3.2 水蒸气蒸馏法

称取125g粉碎的蜂胶置于2000mL圆底烧瓶中，加入1000mL蒸馏水，加热保持微沸10h，收集蒸馏液，用无水乙醚多次萃取，然后经无水硫酸钠脱水过滤，再将滤液蒸馏浓缩得到1.427g挥发油。

1.3.3 GC-MS分析

样品溶于三氯甲烷中过0.45μm滤膜后进行GC-MS分析。色谱条件：色谱柱为DB-5MS (30m×0.32mm，0.25μm)；载气：氦气，1mL/min；进样口温度260℃；分流进样量：1μL；分流比：1:20；柱温升温程序：初始50℃，保持1min，以1.5℃/min速度升温至140℃，保持1min；以7.5℃/min速度升温至290℃，保持6min。 MS条件：电子轰击(EI)离子源；电子能量70eV；离子源温度230℃；四极杆温度150℃；接口温度280℃；扫描范围m/z50～550 。

1.3.4 抑菌实验

菌种经复苏后在严格无菌的条件下采用牛津杯法[8] 进行抑菌实验(牛津杯外径8mm)，一定浓度样品溶解于无水乙醇中，两倍稀释法测定最低抑菌浓度(MIC)。

2 结果与分析

采用GC-MS对不同方法萃取得到的蜂胶挥发油进行定性分析，总离子流图见图1、2。GC-MS检出组分经NIST/WILEY检索数据库进行检索并根据文献进行谱图解析，采用峰面积归一化法计算解析组分的百分含量，结果见表1。

由表1可以看出，水蒸气蒸馏法制备的蜂胶挥发油主要的化学成分为：二甲基丁酸(2-methyl-butanoicacid)、苯甲醛(benzaldehyde)、柠檬烯(limonene)、桉叶油醇(eucalyptol)、苯甲醇(benzyl alcohol)、苯乙醇(phenylethyl alcohol)、乙酸苯甲酯(acetic acid,phenylmethyl ester)、苯甲酸(benzoic acid)、2-甲氧基-4-乙烯苯酚(2-methoxy-4-vinylphenol)、愈创醇(guaiol)、甘菊环族化合物。超临界CO2萃取与水蒸气蒸馏法制备的蜂胶挥发油的化学组成不尽相同，除含有较高含量的苯甲醇、甘菊环族及萘甲醇类化合物、愈创醇等物质外，还含有癸醛、烃类(十六烷、十九烷、1-二十二烯、二十四烯等)、异香橙烯环氧化物、肉桂酸肉桂酯(cinnamyl cinnamate)等物质。水蒸气蒸馏法提取过程温度较高，易造成对热不稳定成分的破坏；而超临界二氧化碳萃取蜂胶时主要萃取出较多的非极性化合物，如烷烃、肉桂酸肉桂酯等。笔者曾采用固相微萃取SPME-GC/MS联用技术分析蜂胶中挥发性成分[9]，分析出蜂胶中挥发性成分有萜烯类、醇、醛、酮、酯等，其中甲酸、乙酸、苯甲酸、苯甲醇、乙酸苯乙酯是所测定的蜂胶挥发性成分的主要贡献物质，说明不同萃取方法得到的蜂胶挥发油成分存在显著差异。巴西蜂胶多来源于酒神菊属等植物，Atungulu等[10]采用同时蒸馏法萃取巴西蜂胶，GC-MS鉴别出30多种挥发性成分，其中主要成分为丙烯、乙酰苯、β-芳樟醇和丁香烯等。可见不同胶源植物来源的蜂胶在挥发油的化学成分上也有着较大不同。

表2结果表明，样品质量浓度在10mg/mL时，两种提取方法所制得挥发油均对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌3种菌产生明显的抑菌作用。两种提取方法所制得挥发油对金黄色葡萄球菌的抑制效果最好，而超临界二氧化碳萃取法提取的蜂胶挥发油较水蒸气蒸馏法提取的挥发油对金黄色葡萄球菌及枯草芽孢杆菌的抑菌圈更大。Melliou等[11]报道了希腊蜂胶的挥发性

成分具有良好的抗细菌和真菌的功效，其抑菌活性可能与主要成分a-蒎烯有关。超临界萃取法和水蒸气蒸馏法萃取的蜂胶挥发油中均含有大量的抑菌成分如苯甲醇、苯甲酸、甘菊环族及萘甲醇类化合物等，它们可能是挥发油中产生抑菌效果的主要物质。

由表3可知，当超临界法萃取的挥发油质量浓度超过1.25mg/mL时，金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌的生长开始受到抑制；铜绿假单胞菌的最小抑菌浓度为10mg/mL。而水蒸气蒸馏法的抑制效果不及超临界萃取法，不同细菌的最小抑菌浓度均大于超临界法萃取得到的挥发油。

3 结论

本研究采用水蒸气蒸馏和超临界CO2萃取法获得了蜂胶挥发油。水蒸气蒸馏法制备的蜂胶挥发油主要的化学成分为：二甲基丁酸、苯甲醛、柠檬烯、桉叶油醇、苯甲醇、苯乙醇、乙酸苯甲酯、苯甲酸、2-甲氧基-4-乙烯苯酚、愈创醇、甘菊环族化合物，而超临界CO2制备的蜂胶挥发油苯甲醇、甘菊环族及萘甲醇类化合物、愈创醇、癸醛、部分烃类、异香橙烯环氧化物、肉桂酸肉桂酯等。抑菌实验表明，两种萃取方法得到的挥发油对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌具有抑制作用。最小抑菌浓度测定结果表明，超临界法萃取的挥发油的抑制效果强于水蒸气蒸馏法。

参考文献:

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