蜂胶提取物的抗氧化活性研究

摘要：以菜籽油和猪油为实验油，采用schall烘箱法测定蜂胶及其乙醇提取物、超临界CO₂提取物和CO₂残渣醇提物的抗氧化活性，并与其他通用抗氧化剂比较。

结果表明：总黄酮浓度0.01%以上的蜂胶提取物均能显著延长油脂氧化诱导期，是高效的油脂抗氧化剂；黄酮类化合物仍是各蜂胶提取物中主要含量成分和主要抗氧化活性成分之一，且随总黄酮浓度0.005%以上一定范围与其整体抗氧化活性呈现量效关系；在相同添加量0.02%（蜂胶提取物均以总黄酮计）和恒温60 ℃条件下，各抗氧化剂抗氧化效果按强弱顺序排列为：菜籽油中，TBHQ＞蜂胶超临界CO₂提取物＞蜂胶CO₂残渣醇提物≥蜂胶乙醇提取物＞VE＞甘氨酸＞蜂胶＞BHT；猪油中，TBHQ＞蜂胶CO₂残渣醇提物≥蜂胶乙醇提取物≥BHT＞甘氨酸＞蜂胶＞蜂胶超临界CO₂提取物＞VE。本试验结果可望为各蜂胶提取物将来被用作含油脂食品的天然抗氧化剂提供一定的实验数据。

蔡君，宋欢 （重庆市日用化学工业研究所，重庆 401123）

关键词：蜂胶；蜂胶提取物；抗氧化性能；蜂胶乙醇提取物；蜂胶超临界CO₂提取物；蜂胶CO₂残渣醇提物

蜂胶是工蜂采集长寿胶源植物树脂等分泌物与其上颚腺、蜡腺等分泌物混合形成的一种带有柔和香气的胶粘性物质。许多研究证明蜂胶中含有大量的天然有效成分如黄酮类、萜烯类和酚酸类如肉桂酸、咖啡酸、苯甲酸及其脂和衍生物等，具有抗菌、抗病毒、消炎镇痛和抗氧化等多种生物学作用[1]，这些特性使人们正试图开拓蜂胶在食品和药品方面的应用市场。目前各国食品中常用的抗氧化剂大多数是合成的，使用范围较广泛的有丁基羟基茴香醚（BHA）、二丁基羟基甲苯（BHT）、叔丁基对苯二酚（TBHQ）和没 食子酸酯类等，合成的抗氧化剂多少都有些毒性，随着人们健康意识的增强以及崇尚自然潮流的发展，天然抗氧化剂越来越受到人们的欢迎，蜂胶就是被人们看好的，并早已被国内外研究证实是高效、安全无害的天然抗氧化剂之一[2]。国内外学者关于蜂胶抑制油脂氧化作用的研究报道较多，对于蜂胶乙醇提取物的抗氧化性能研究也有报道[3]，但对于蜂胶超临界CO₂提取物和蜂胶CO₂残渣醇提物的抗氧化性能的研究报道甚少。再者，由于蜂胶属于天然产物，是复杂组分的混合体，其中，黄酮类化合物是其主要含量成分和主要抗氧化活性成分之一，然而不同产地品种蜂胶及蜂胶提取物中黄酮类化合物成分及含量等又有较大区别[4,5]，这势必影响到在相同实际添加量下不同品种蜂胶提取物的抗氧化效果，因此，为了蜂胶提取物将来应用作为天然抗氧化剂，考虑其通用有效添加剂量，有必要从量效关系思路探索考查蜂胶提取物中总黄酮含量与其整体抗氧化活性的强弱关系，同时比较在相同总黄酮浓度及实验条件下各蜂胶提取物之间﹑蜂胶提取物与其他抗氧化剂之间的抗氧化活性，以期为更多蜂胶提取物将来被用作含油脂食品的抗氧化剂提供一定的实验数据。

1 材料和设备

1.1 材料

蜂胶：工蜂采集植物树脂等分泌物与其上颚腺、蜡腺等分泌物混合形成的胶粘性物质。实验室经冷冻粉碎制成粉状，过筛除掉机械杂质，测定总黄酮含量11%，乙醇提取物含量54.7%，重庆市蓄科院蜂业研究所提供（湖南产地）；

蜂胶乙醇提取物：乙醇萃取蜂胶后得到的物质。实验室将蜂胶冷冻粉碎，过筛除掉机械杂质后，用85%乙醇常温提取24 h，料液比1:15，回收溶剂后真空干燥得到蜂胶乙醇提取物。块状粉碎后制成棕褐色至棕黄色粉状，测定总黄酮含量20%，乙醇提取物含量97.1%。

蜂胶超临界CO₂提取物：超临界CO₂流体萃取蜂胶后得到的物质。实验室将蜂胶冷冻粉碎，过筛除掉机械杂质后，用超临界CO₂萃取，萃取压力35 MPa，萃取温度32 ℃，萃取时间4 h，CO₂流量19 L/h，分离塔出料得到蜂胶超临界CO₂提取物。呈棕黄色至金黄色膏状，测定总黄酮含量5.6%，乙醇提取物含量60.7%。

蜂胶CO₂残渣醇提物：超临界CO₂流体萃取蜂胶后的残渣再用乙醇萃取得到的物质。实验室将蜂胶冷冻粉碎，过筛除掉机械杂质后，先用超临界CO₂萃取，萃取塔出料残渣再用85%乙醇进一步常温提取24 h，料液比1:15，回收溶剂后真空干燥得到蜂胶CO₂残渣醇提物。块状粉碎后制成棕褐色至棕黄色粉状，测定总黄酮含量24%，乙醇提取物含量97.5%。

菜籽油（市售新鲜瓶装产品，未添加任何抗氧化剂）；猪油，板猪油新鲜熬制过滤后冰箱储备。

1.2 试剂

特丁基对苯二酚（TBHQ）、二丁基羟基甲苯（BHT）、维生素E（含量98%）、甘氨酸、95%食用酒精等均为食用级。

1.3 设备

HA221-50-06-C型超临界萃取仪（江苏南通华安超临界萃取有限公司）；UV-1200型紫外/可见分光光度计（上海美谱达仪器有限公司）；WS/08-01 调温调湿箱（重庆试验设备厂）。

2 试验方法

2.1 蜂胶中总黄酮含量测定

按国家标准《蜂胶中总黄酮含量的测定方法 分光光度比色法》GB/T20574-2006执行。

2.2 蜂胶中乙醇提取物含量测定

按国家农业行业标准《无公害食品 蜂胶》NY5136-2002执行。

2.3 蜂胶及提取物的GC-MS分析

2.3.1 样品的制备

分别称取蜂胶及其乙醇提取物、超临界CO₂提取物、CO₂残渣醇提物各试样4 g（精确到0.001 g）放入研钵，加入少量75%乙醇液研磨成糊状移入锥形瓶内，用乙醇液冲洗研钵合并于锥形瓶内，使乙醇液体积达到４0 mL，盖好瓶塞室温浸提24 h；过滤提取液到50 mL容量瓶内，用少量乙醇冲洗锥形瓶及滤纸，滤液定溶至50 mL，得各样的醇溶液。

2.3.2 GC-MS 检测条件

气相色谱条件：色谱柱为Rtx-1ms (30 m×0.25 mm×0.25 μm)，载气为高纯He (99.999%)，分流比100:1。程序升温：以9 ℃/min从初始温度40 ℃升温至80 ℃保持3 min，再升温至150 ℃保持5 min，再升温至220 ℃保持46 min。质谱条件：E1离子源，电离能70 eV，离子源温度200 ℃，接口250 ℃，柱前压47 kPa，电子倍增器1.2 kV。进样量0.3 μL，扫描范围40~600 amu，全扫描方式。所得质谱数据用美国NIST质谱数据库检索，用面积归一化法确定各组分的相对含量。

2.3.3 蜂胶及提取物主要有效成分的统计分析

对蜂胶、蜂胶乙醇提取物、蜂胶超临界CO₂提取物及蜂胶CO₂残渣醇提物主要有效成分及含量的GC-MS分析结果进行分类统计。

2.4 抗氧化剂溶液的制备

2.4.1 蜂胶溶液的制备

本实验按100 g油品中主要成分总黄酮浓度依次为0.005%、0.01%、0.02%、0.03%分别称取蜂胶、蜂胶乙醇提取物、蜂胶超临界CO₂提取物及蜂胶CO₂残渣醇提物的实际重量于三角瓶中，各用同等少量95%食用酒精溶解，制成各蜂胶溶液样品。

2.4.2 其他抗氧化剂溶液的制备

按100 g油品中抗氧化剂纯品添加量为0.02%分别称取TBHQ、BHT、维生素E、甘氨酸的实际重量于三角瓶中，各用同等少量95%食用酒精溶解，制成各抗氧化剂溶液样品。

2.5 样品抗氧化能力的检测

以菜籽油和猪油为底物，在相同实验条件下，对不同品种、不同纯品添加量的抗氧化剂样品的抗氧化活性进行测试。

参照schall烘箱法，将100 g油品分别加入到盛有不同品种、不同纯品添加量的抗氧化剂溶液样品的三角瓶中，混合均匀，置于60 ℃的恒温箱内，加速其氧化，每隔一定时间取油样测定其过氧化值（POV值，按《食用植物油卫生标准的分析方法》GB/T 5009.37-2003测定），同时跟踪统计出每一个油样POV值达到终点值所用的时间（天数）-氧化诱导期。从而考查不同品种、不同纯品添加量的抗氧化剂的抗氧化性能。

3  结果与讨论 

3.1蜂胶及提取物的主要有效成分及含量

图1~4分别是湖南蜂胶及各提取物中醇溶物的总离子流图，经计算机检索及人工解析质谱，蜂胶分离出183个成分，鉴定出其中72个成分；蜂胶乙醇提取物仅分离出144个成分，鉴定出其中63个成分；蜂胶CO₂残渣醇提物分离出200个成分，鉴定出其中78个成分；蜂胶超临界CO₂提取物分离出189个成分，鉴定出其中88个成分。

表1统计了蜂胶、蜂胶乙醇提取物、蜂胶超临界CO₂提取物及蜂胶CO₂残渣醇提物主要有效成分及含量的GC-MS分析结果。

表1结果可知，采用乙醇和超临界CO₂流体两种溶剂分别提取和先后提取蜂胶，所得各蜂胶提取物的主要有效成分和相对含量等均有不同。相同的是，黄酮类成分、萜烯醇类成分、酚酸类成分如肉桂酸、阿魏酸、苯甲酸及衍生物等从高到低依次仍是各自的主要含量成分；区别较大的是，与蜂胶相比，黄酮类成分在蜂胶超临界CO₂提取物中的含量有明显降低（43.06%），其中白杨素和高良姜素含量显著降低（分别为0.02%和0.97%），柚皮素含量显著提高（14.08%）；酚酸类成分的含量在蜂胶提取物中均有提高,尤其在蜂胶超临界CO₂提取物中（如肉桂酸及其衍生物等）的含量明显提高（9.42%）；萜烯醇类成分在蜂胶超临界CO₂提取物中（如愈创木醇、雪松醇、桉叶油醇等）的含量也有明显提高（26.16%）[5]。

3.2 蜂胶及提取物抗氧化活性比较 在相同总黄酮浓度0.005%、0.01%、0.02%、0.03%和实验条件下，添加蜂胶、蜂胶乙醇提取物、蜂胶超临界CO₂提取物及蜂胶CO₂残渣醇提物各试样对油脂的抗氧化效果，同时追踪各试样油的氧化诱导期，结果见表2。

从表2可知，没有添加任何试剂的空白油品氧化 速度最快，其次是加入95%食用酒精的油品；总黄酮浓度0.01%以上的蜂胶及提取物均能显著延长油脂氧化诱导期，具有较好的抗氧化活性；在0.005%以上一定范围随总黄酮浓度增加与蜂胶及提取物整体的抗氧化活性存在量效关系；且随总黄酮浓度增加到0.02%时均有显著提高，特别是植物油中蜂胶超临界CO₂提取物的抗氧化活性显著更强，反映出蜂胶超临界CO₂提取物组分中另有复杂多种丰富含量的酚酸类或萜稀醇类化合物在植物油中同时具有很强的抗氧化活性，起到协同增强作用。当总黄酮浓度达到0.03%时各蜂胶提取物抗氧化活性相对有所下降或趋于稳定，这应与蜂胶提取物在油脂中的溶解度有关系。

国家标准GB2760中允许使用的抗氧化剂大多有严格的添加量限制，其中大多数天然抗氧化剂属于复杂组分混合体，因有效成分纯度较低，毒性低，添加量普遍远高于化学合成品抗氧化剂的添加量（合成品纯度高，添加量少，存在毒性），基于此，可将蜂胶总黄酮浓度折算成蜂胶提取物的实际添加量后再应用，使其抗氧化效果更稳定，重复性更好。 3.3 蜂胶提取物与常用抗氧化剂的抗氧化活性比较 在相同添加量0.02%（蜂胶提取物均以总黄酮计）和恒温60 ℃条件下，各抗氧化剂对菜籽油和猪油的抗 氧化效果，结果见图5、图6。

从图5和图6可知，各抗氧化剂的抗氧化效果按强弱顺序排列为：菜籽油中，TBHQ＞蜂胶超临界CO₂提取物＞蜂胶CO₂残渣醇提物≥蜂胶乙醇提取物＞VE＞甘氨酸＞蜂胶＞BHT；猪油中，TBHQ＞蜂胶CO₂残渣醇提物≥蜂胶乙醇提取物≥BHT＞甘氨酸＞蜂胶＞蜂胶超临界CO₂提取物＞VE。比较结果表明：在相同添加量0.02%（蜂胶提取物均以总黄酮计）和恒温60℃条件下，菜籽油中，各蜂胶提取物的抗氧化活性均显著好于通用抗氧化剂合成品二丁基羟基甲苯（BHT）、天然品维生素E、甘氨酸，仅次于合成品特丁基对苯二酚（TBHQ）；猪油中，蜂胶CO₂残渣醇提物和蜂胶乙醇提取物与BHT相当，均有较强的抗氧化活性，强于甘氨酸，显著强于维生素E，仅次于TBHQ，而蜂胶超临界CO₂提取物的抗氧化活性略低于甘氨酸，但仍强于维生素E。

蜂胶的抗氧化机理与其组分的复杂构成有关，往往是多种有效成分协同作用的结果。据报道，蜂胶中含有丰富的黄酮类化合物和多种酚羟基类化合物等均能表现出很强的抗氧化能力[6]，一方面能与金属离子生成螯合物，特别是抑制F2+诱导的脂质过氧化作用，并呈现量效关系，同时对高温诱导的脂质过氧化作用也有很强的推迟能力，另一方面能猝灭超氧阴离子和羟基自由基，作为氢给予体和自由基接受体起着抑制自由基引起的连锁反应的作用，也呈现量效关系。因此，蜂胶是以多种机理、多种方式起着协同抗氧化作用[7]。

4 结论

4.1 以菜籽油和猪油为实验油，采用schall烘箱法测定蜂胶、蜂胶乙醇提取物、蜂胶超临界CO₂提取物及蜂胶CO₂残渣醇提物的抗氧化活性，并与其他通用抗氧化剂比较。结果表明：总黄酮浓度0.01%以上的蜂胶提取物均能显著延长油脂氧化诱导期，具有较好的抗氧化活性；各蜂胶提取物中黄酮类化合物是主要的抗氧化活性成分之一，且随总黄酮浓度0.005%以上一定范围与其整体的抗氧化活性呈现量效关系；在相同添加量0.02%（蜂胶提取物均以总黄酮计）和恒温60 ℃条件下，与通用抗氧化剂比较按强弱顺序排列为：菜籽油中，TBHQ＞蜂胶超临界CO₂提取物＞蜂胶CO₂残渣醇提物≥蜂胶乙醇提取物＞VE＞甘氨酸＞蜂胶＞BHT；猪油中，TBHQ＞蜂胶CO₂残渣醇提物≥蜂胶乙醇提取物≥BHT＞甘氨酸＞蜂胶＞蜂胶超临界CO₂提取物＞VE。

4.2 实验证明蜂胶提取物是高效的油脂抗氧化剂，因此，可利用其特性且有益于身体健康的多种生物活性,将其纳入食品添加剂国家标准中使其能规范化、合法化推向市场，并可结合其他天然组分，开发出含蜂胶提取物的复合型防腐抗氧保鲜剂产品，取代或部分取代化学合成品的抗氧化剂，既安全、高效抗菌、抗氧化，又经济实用，应用于大宗特色鲜果蔬、肉制品、禽蛋、乳制品等食品的防腐保鲜是完全切实可行的，也顺应当前市场对天然食品保存剂的迫切需要。

参考文献：

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[3] 乞永艳,骆尚骅,刘富海,等.蜂胶乙醇提取物抗氧化性能研 究[J].食品科技,2000,4:43-44

[4] 崔庆新,刘国富.蜂胶乙醇提取物化学成分的GC/MS研究 [J].天然产物研究与开发,2001,6:36-38

[5] 蔡君,谭群,晏家瑛,等.不同提取工艺下蜂胶醇提物的GC- MS分析[J].现代食品科技,2010,26(5):544-550

[6] 郑研,朱利民.酚酸类化合物的应用及改性研究新进展[J]. 应用化工,2007,9:918-921

[7] 叶振生.蜂产品深加工技术[M].北京:中国轻工业出版社, 2003