蜂胶总黄酮对四氧嘧啶糖尿病大鼠降血糖作用

目的: 探讨蜂胶总黄酮（TFP）对四氧嘧啶（ALX）糖尿病模型大鼠降血糖作用及其机制。

方法: 采用四氧嘧啶（150mg·kg－1）腹腔注射法建立糖尿病大鼠模型，根据血糖值随机分为模型对照组、蜂胶总黄酮高剂量组（240mg·kg－1）、蜂胶总黄酮中剂量组（120mg·kg－1）和蜂胶总黄酮低剂量组（60mg·kg－1 ），并将同批未经上述处理的大鼠作为正常对照组，每组10只大鼠。期间蜂胶总黄酮高、中、低剂量组每天灌胃给药1次，正常对照组与模型对照组给予同体积0.5%羧甲基纤维素钠（CMC-Na），连续4周。每周测血糖1次，末次给药结束后，禁食12h，乙醚麻醉，取肝组织测肝糖原，腹主动脉取血，检测糖尿病大鼠血清中血糖（GLU）、胰岛素（INS）、C肽（C-P）、糖化血红蛋白（GHb）、一氧化氮（NO）、超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、谷胱甘肽（GSH）及肝糖原水平。结果 与正常对照组大鼠比较，模型对照组大鼠血糖、糖化血红蛋白、一氧化氮及丙二醛水平明显升高（P＜0.05或P＜0.001），胰岛素、C肽、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽及肝糖原含量明显降低（P＜0.01或P＜0.001）。与模型对照组比较，蜂胶总黄酮高、中、低剂量组血糖、糖化血红蛋白、一氧化氮及丙二醛水平明显降低（P＜0.05或P＜0.01或P＜0.001），胰岛素、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽及肝糖原含量明显升高（P＜0.05或P＜0.001），而C肽仅在蜂胶总黄酮高、中剂量组明显升高。

结论: 蜂胶总黄酮可通过增加机体的抗氧化能力，促进胰岛细胞分泌功能恢复而发挥降血糖作用。

关键词: 蜂胶总黄酮；四氧嘧啶；降血糖；氧化应激

蜂胶是蜜蜂从植物嫩芽及树干上采集的树脂，混入自身上颚腺分泌物和蜂蜡而成的一种具有芳香气味的胶状固体物，是蜜蜂用来抵御病原微生物侵入蜂巢和内环境消毒杀菌的一种物质^[1]。蜂胶具 有抗菌、 抗病毒、抗氧化、清除体内的有害物质、增强机体免疫等功能^[2]。蜂胶的化学成分非常复杂，主要包括黄酮类、萜烯类、酚酸类化合物等成分^[3]。黄酮类化合物为蜂胶主要活性成分。我们从蜂胶中分离纯化出蜂胶总黄酮，总黄酮含量为52.1%。本实验采用四氧嘧啶（ALX）腹腔注射法建立糖尿病大鼠模型，探讨蜂胶总黄酮（TFP）对ALX糖尿病大鼠降血糖作用及其机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

Wistar大鼠60只，雄性， 250～280g［合格证号：SCXK-（吉）2008-0005，吉林大学实验动物中 心］ 。

1.2 药品

取蜂胶药材，－4℃～4℃冷冻4～6h，粉碎成粗粉，与蜂胶质量六分之一的乙醇混合，置萃取罐中，萃取压力20～30MPa，萃取温度为40～60℃，萃取3～5h；分离釜压为6.0～7.0MPa；减压回收溶液，得萃取物；减压干燥，粉碎成细粉，既得。实验 时用0.5%CMC-Na配成所需浓度。

1.3 试剂

葡萄糖（GLU）测定试剂盒（批号：2010015，长春汇力生物技术有限公司）；肝糖原测定试剂盒（批号：2010110）、糖化血红蛋白（GHb）测定试剂盒（批号：20100417）、一氧化氮（NO）试剂盒（硝酸还原酶法，批号：20100330）、总超氧化物歧化酶（SOD）测试盒（批号：20100704）、丙二醛（MDA）测定试剂盒（批号：20100705）、谷胱甘肽（GSH）测定试剂盒（批号：20100707）、肝糖原测定试剂盒（批号：2010114）（南京建成生物工程研究所）；ALX（批号：445307/1，Sigma公司，实验时现用现配）；ＲatC-PELISAKit（LOT#C103-06）、ＲatINSELISAKit（LOT#I092-08）（GroundworkBiotechnologyDiagnosticateLtd）。

1.4 仪器

T6紫外可见分光光度计（北京普利生有限公 司）；ST－360酶标仪（上海科华实验系统有限公司）。

1.5 动物分组及给药

取雄性Wistar大鼠60只，适应性喂养1周后，随机分为正常对照组10只，造模组50只。隔夜禁 食12h后，造模组大鼠腹腔注射ALX150mg·kg－1（用生理盐水新鲜配制），正常对照组腹腔注射同体积的生理盐水。注射ALX1周后尾尖取血测血糖，以随机血糖＞13.5mmol·L－1 作为糖尿病模型标准，将模型成立的大鼠按血糖值随机分为模型对照组，TFP高剂量组（240mg·kg－1），TFP中剂量组（120mg·kg－1），TFP低剂量组（60mg·kg－1），每组10只大鼠。期间TFP高、中、低剂量组每天灌胃给药1次，正常对照组与模型对照组给予同体积的0.5%CMC-Na，连续4周。每周测血糖1次。末次给药结束后，禁食12h，乙醚麻醉，取肝组织测肝糖原，腹主动脉取血，检测糖尿病大鼠血清中GLU、INS、C-P、GHb、NO、SOD、MDA、GSH及肝糖原水平。

1.6 统计学分析

统计分析采用PASWStatistics17.0版统计分析软件，多组之间采用单因素方差分析比较，组间比较采用t检验，结果以平均数±标准差（珋x±s）表示。

2 结果

2.1 TFP对糖尿病大鼠血糖的影响

与正常对照组比较，ALX模型组大鼠血糖含量在各个观察时间点较正常对照组均明显升高（P＜0.001）；与模型对照组比较，在各个观察时间点，TFP高剂量组大鼠血糖含量均明显降低（P＜0.05或P＜0.001）；TFP中剂量组大鼠血糖含量在给药第2周后，出现明显降低（P＜0.05或P＜0.001）；TFP低剂量组大鼠血糖在给药第3周后，出现明显降低（P＜0.05或P＜0.001），给药第1周和第2周低剂量大鼠血糖含量均低于模型组，但均无统计学差异（P＞0.05）。见表1。

表1 蜂胶总黄酮（TFP）对糖尿病大鼠血糖的影响．n=10，x±s

Tab.1 Effect of TFP on blood glucose in diabetic rats．n=10，x±s

2.2 TFP对糖尿病大鼠INS、C-P、NO及GHb含量的影响

与正常对照组比较，模型组大鼠NO及GHb含 量明显高于正常对照组（P＜0.01），INS及C-P水平明显低于正常对照组（P＜0.001）；与模型组比较，TFP高剂量组与中剂量组大鼠NO及GHb水平均低于模型组（P＜0.01或P＜0.001），INS及C-P水平明显高于模型组（P＜0.05或P＜0.001）；低剂量组大鼠NO及GHb水平明显降低（P＜0.05或P＜0.01），INS水平明显升高（P＜0.05），C-P水平高于模型组，但无统计学差异（P＞0.05）。见表2。

表2 TFP对糖尿病大鼠INS、C-P、NO及GHb的影响．n=10，x±s

Tab.2 EffectofTFPonINS，C-P，NOandGHbindiabeticrats．n=10，x±s

2.3 TFP对糖尿病大鼠SOD、MDA、GSH及肝糖原的影响

与正常对照组比较，模型组大鼠MDA水平明 显高于正常对照组（P＜0.001）， SOD、GSH及肝糖原含量明显低于正常对照组（P＜0.01或P＜0.001）；与模型组比较，TFP高剂量组与中剂量大鼠MDA水平均明显降低（P＜0.01或P＜0.001），SOD、GSH及肝糖原水平则明显升高（P＜0.05或P＜0.001）；TFP低剂量组大鼠MDA明显降低（P＜0.05），SOD、GSH水平明显升高（P＜0.05），肝糖原含量高于模型组，但无统计学差异（P＞0.05）。见表3。

表3 TFP对糖尿病大鼠SOD、MDA、GSH及肝糖原的影响．n=10，x±s

Tab.3 EffectofTFPonSOD，MDA，GSHandHepaticglycogenindiabeticrats．n=10，x±s

3 讨论

糖尿病是一种常见病多发病，其病因复杂，通常表现为血糖持续升高。检测空腹血糖只能反映瞬时血糖的变化，长期检测血糖值才能真实反映机体的血糖水平；GHb与血糖浓度呈正相关，它能反映机 体对血糖长期的控制水平^[4-5]；肝糖原亦是血糖含量非常重要的调节点，肝糖原合成减少或分解增多均 可以引起血糖水平的升高^[6]；同时检测上述3个指标能够更全面客观地反映血糖水平的变化。本实验中，对ALX糖尿病大鼠进行4周血糖检测，发现模型组大鼠血糖值持续升高，而TFP各剂量组血糖水平均有明显降低；末次给药结束后，发现GHb水平明显降低，而肝糖原明显升高，提示TFP对ALX糖尿病大鼠血糖水平具有较好的调节作用。此外，INS与C-P均为胰岛β细胞的分泌产物，研究证明，检测血清C-P水平能准确反映出胰岛β细胞的分泌功能；本实验结果显示，模型组的INS及C-P水平均明显低于正常对照组，表明模型组大鼠胰岛β细胞 分泌功能出现异常，TFP能明显升高INS与C-P水平，提示TFP可明显改善ALX糖尿病大鼠糖代谢紊乱状况，并能促进胰岛β细胞分泌功能的恢复，发挥降血糖作用。

高糖氧化应激与糖尿病及其并发症之间密切相关。它是糖尿病、胰岛素抵抗和心血管疾病共同的发病机制。氧化应激是机体因遭受各种有害刺激时，体内产生过多的氧自由基；清除能力下降，当氧化系统和抗氧化系统失衡时，就会导致机体组织和功能的损伤^[7]，而脂质过氧化是自由基过多而导致的过氧化反应的结果，并通过链式反应，增加氧化应激的损伤作用^[8]。MDA是常见的脂质过氧化产物， 其含量可以衡量机体脂质过氧化的程度，可间接反映细胞受损伤的程度^[9-10]；NO是一种气体自由基，在糖尿病的始动机制、胰岛素抵抗以及胰岛β细胞功能障碍中均发挥重要作用^[11]；SOD与GSH是清除体内氧自由基的一组非常重要的酶，其活性降低会导致氧自由基代谢产物在体内的堆积^[12]。本实验中，模型组大鼠血清MDA及NO含量较正常对照组明显升高，SOD及GSH水平较正常对照组明显降低，说明糖尿病大鼠体内产生大量的脂质过氧化反应，其胰岛结构与功能均受到损伤，导致了血糖水平的升高。采用TFP干预后，TFP治疗组大鼠MDA和NO含量较模型组均明显降低、SOD和GSH活性较模型组明显增强，说明TFP可增强机体抗氧化酶的活性，降低糖尿病引发的脂质过氧化反应，发挥抗氧化作用。

综上所述，TFP具有良好的降血糖作用，其作用机制与清除体内自由基，提高机体抗氧化能力及修复受损的胰岛β细胞有关。

参考文献:

[1] XU Y，GU L . Study on antioxidant activity of ethanol extracts or propolis [J].J Harbin Univ Com（Nat Sci）（哈尔滨商业大学学报：自然科学版），2007，23（3）：277-278.

[2] BANSKOTA A H，TEZUKA Y，KADOTA S，et al .Ｒecent pro-gress in pharmacological research of propolis[J] .Phytother Ｒes，2001，15（7）：561-571.

[3] DONG J，ZHANG H C，YIN C，et al.Ｒecent research progress of bee propolis[J] . J Food Sci（食品科学），2007，28（9）：637-642.

[4] HU Y X，HU C S，HU Y M，et al . Effects of Beijing propolis immune function in mice［J］. Prac Preven Med（实用预防医学），2005，12（5）：1049-1052.

[5] ZHAO Y L，YE S D，CHEN Y P，et al . Contribution of HbA 1 c levels to the lipid disorder and its complications in T2 DM patients［J］. ChinJDiabet（中国糖尿病杂志），2013，21（2）：157-159.

[6] MAKITA Z，VLASSAＲA H，CEＲAMI A，et al．Immunochemical detection of advanced glycosylafion end products in vivo［J］. J Biol Chem，1992，267（8）：5133-5138.

[7] LUSHCHAK V I . Free radical oxidation of proteins and its rela-tionship with functional state of organism［J］. Biolchemistry（Mosc），2007，72（8）：809-827.

[8] SUＲAPANENI K M，VENKATAＲAMANA G . Status of lipid peroxidation，glutathione，ascorbic acid，vitamin E and antioxi-dant enzymes in patients with osteoarthritis［J］. Indian J Med  Sci，2007，61：9-14.

[9] HAIXIA C，MIN Z，BIJUN X . Components and antioxidant ac-tivity of polysaccharides conjugate from green tea［J］.Food Chem，2005，90：17-21.

[10] JIANG H F，LI X Ｒ，CHEN X L，et al．Effect of purple sweet potato flavnids on blood glucose and oxidative stress in diabetic rats［J］.Chin Pharm J（中国药学杂志），2011，46（20）：1570-1573.

[11] BAIN K，KE Y，KAMINSKI Y，et al . Proteomic modifica-tion by nitric oxide［J］.Pharmacol Sci，2006，101（4）：271-278.

[12] CHUNG S S，KIM M，YOUN B S，et al .Glutathione peroxidase 3 mediates the antioxidant effect of paroxysms proliferators-activa-ted receptor grmma in human skeletal muscle cells［J］.Mol Cell Biol，2009，29（1）：20-30.