蜂胶体外诱导喉癌细胞凋亡的实验研究

【摘要】目的：探讨蜂胶对喉癌细胞珠Ｈep-2凋亡的影响及作用机制。方法用流式细胞仪、原位末端标记法、激光共聚焦显微镜等技术，观察蜂胶对细胞的抑制、凋亡情况及细胞内Ca²⁺变化。结果：蜂胶能抑制Hep-2细胞的生长、诱导喉癌细胞凋亡，非特异性地阻滞Hep-2细胞周期的全过程。原位末端标记检测出细胞凋亡率亦有时间、剂量依赖性。细胞内Ca²⁺随蜂胶浓度的增加而升高，且具有统计学意义。结论：蜂胶能够抑制喉癌细胞生长，其抑制作用是通过诱导喉癌细胞凋亡而起作用的。

王菊香1，郑海萍2，裴士庚2，门金娥2，张向阳2   （1 河北工程大学医学院，河北 邯郸 056029；2 河北工程大学临床医学院，河北 邯郸 056029）

【关键词】蜂胶；Hep-2细胞；细胞凋亡

目前，喉癌的治疗是以手术为主的综合治疗，化疗是其中重要的组成部分，用于喉癌的化疗药物尚缺乏理想的选择性。蜂胶是蜜蜂从植物的幼芽及树木的枝条上采集树脂类物质，与其唾液混合加工成一种芳香性胶状固体物，含有多种黄酮、槲皮素、肉桂酸衍生物、多糖、氨基酸等有药理活性的化合物^[1]。它不仅具有抗病原微生物、抗氧化、抗炎、护肝等作用，还具有抗肿瘤作用。为进一步探讨其抗癌作用机理，我们观察了蜂胶对喉癌Hep-2细胞凋亡的影响。现报道如下。

1 材料

1.1 蜂胶提取物取本地产蜂胶，冰冻粉碎后以95%乙醇浸泡72h，过滤，滤液于40℃减压挥干溶剂，二甲基亚砜（DMSO）溶解定容为2mg/ml。

1.2 试剂及仪器RPMI1640培养液为美国GIBCO公司产品；FACSCalibur流式细胞仪为美国BECTON  DICKINSON公司产品；POD试剂盒购自华美生物工程公司；MRC-1024激光共聚焦显微镜（BIO-RAD公司产品）。

1.3 细胞株人喉鳞状细胞癌Hep-2细胞株由白求恩国际和平医院耳鼻喉头颈外科实验室惠赠。

2 方法

2.1 蜂胶浓度分组实验前用RPMI1640(Gibco公司)将蜂胶提取物稀释成20，40，80，160 μg/ml，DMSO的浓度低于0.02%。

2.2 流式细胞仪检测收集对照组和80μg/ml蜂胶作用不同时间(24，48，72 h)的细胞，用PBS洗涤2遍，经柠檬酸缓冲液固定1h以上，上机前加1800μl胰酶消化液充分作用，加入1500μl碘化丙啶(PI)作用15min以上，过滤，上机进行细胞凋亡分析和细胞周期分析。

2.3 原位末端标记法(TUNEL)定量检测分别于各剂量药物作用后24，48，72 h收集细胞，PBS洗2次，细胞涂片，室温干燥。按原位细胞凋亡检测试剂盒说明进行操作，用普通光镜计算凋亡率(AI)。计算方法：随机选取5个高倍视野，分别计阳性细胞数及总细胞数，代入下式：AI=阳性细胞数/总细胞数×100%。

2.4 Hep-2细胞内Ca²⁺变化的激光共聚焦显微镜检测对数生长期Hep-2细胞，用D-Hanks液洗涤2次，于37℃避光条件下Fluo-3/AM（10 μmol/L）荷载。40 min后用D-Hanks液洗涤细胞3次，洗去细胞外残余染料，最后保留少许细胞外D-Hanks缓冲液，平衡10 min。经不同浓度蜂胶作用不同时间，在激光共聚焦显微镜下扫描细胞内荧光强度，激发波长488 nm，发射波长526 nm，以本底荧光强度为参照（0），检测细胞内Ca2+荧光强度。

2.5 数据统计学处理采用SPSS10.0统计软件进行统计处理，计量资料用±s表示，比较时采用t检验。α=0.050。

3 结果

3.1 流式细胞仪检查结果80μg/ml蜂胶对Hep-2细胞凋亡率的影响：24，48，72 h时Hep-2细胞抑制率分别为36.2%，44.5%，58.6%，时间越长细胞凋亡率越高（P<0.05）。24，48，72 h时G0/G1期细胞分别占67.2%，55.8%，59.4%；S期分别占19.1%，28.3%，33.5%；G₂/M期分别占13.7%，15.9%，7.1%。

3.2 TUNEL标记各组细胞凋亡率明显升高，与同时间对照组比较差异有显著性，且呈现一定的时间、剂量依赖性。见表1。

3.3 Hep-2细胞内Ca²⁺的变化 结果见表2。随药物浓度的增加，不同浓度组之间的细胞内Ca²⁺荧光强度亦增高。P<0.05。

4 讨论

蜂胶是蜜蜂从植物的幼芽及树干上采集的树脂，并混入其上腭腺分泌物、蜂蜡和少量的花粉加工而成的一种具有芳香气味的胶状固体物。目前，已知蜂胶中所含抗癌有效成分有：黄酮类、萜烯类、多糖物质、酯类化合物等及其他化合物的天然组合，它们之间相互协调作用，赋予了蜂胶的抗癌作用^[1]。实验表明，蜂胶可抑制由化学致癌物诱发的基因突变^[2]。由于放疗、化疗在杀伤肿瘤细胞的同时，也会损伤机体的免疫活性细胞及造血细胞，因此，强化机体免疫、对抗放疗、化疗引起的副作用，是当今肿瘤防治工作重要任务之一。大量研究表明，蜂胶是一种天然的免疫强化剂，同时又兼有抗肿瘤、抗病毒、抗菌的活性^[3]。本实验表明蜂胶对Hep-2细胞具有明显的抑制作用，可诱导Hep-2细胞凋亡，且对细胞周期有一定的影响，既可影响细胞周期G1期向S期转变，又可影响S期向G₂M期的转变过程，导致肿瘤细胞凋亡，非特异性阻滞细胞周期的全过程。在此基础上，用TUNEL法定量观察蜂胶诱导Hep-2细胞凋亡的规律。Hep-2细胞有一定的自然凋亡率，但蜂胶组中的阳性细胞数明显多于对照组，且具有时间、剂量的依赖性。随着蜂胶浓度的增加，对癌细胞的杀伤作用也在增强。

Ca²⁺信号传导在细胞凋亡机制研究中的作用日益受到人们重视。大多数细胞在凋亡过程中，细胞内Ca²⁺均有所增加^[4-6]。本实验结果显示，蜂胶作用后Hep-2细胞内Ca²⁺相对荧光强度明显高于对照组，且随着药物浓度的增高，Ca²⁺荧光强度亦增高。提示Ca²⁺的变化在蜂胶诱导Hep-2细胞凋亡中起重要作用，可能系其诱导凋亡的关键机制之一。本实验揭示，蜂胶能够抑制喉癌细胞的生长，其抑制作用是通过凋亡机制起作用的。

【参考文献】

［1］郭芳彬.蜂胶的抗癌作用［J］.蜜蜂杂志，2003，9（1）：10.

［2］王菊香，裴士庚，门金娥，等.蜂胶乙醇提取物基因抗突变作用的研究［J］.癌变·畸变·突变，2005,17（1）:39.

［3］郭芳彬.蜂胶的抗菌作用［J］.蜜蜂杂志，2004，10（3）：10.

［4］Choi YH，Lee WY，Nam SY，et al．Apotosis induced by propolis in human hepatocelluar carcinoma cell line［J］.Int J Mol Med,1999,4:29.

［5］Mc Ginnis KM，Wang KK，Gnegy ME.Alterations of extracellular calcium elicit selective modes of cell death and protease activation in SH SY5Y human neuroblastoma cells.［J］.J Neurochem，1999，72(5)：1853.

［6］王春梅，黄晓峰，杨家骥，等.激光扫描共聚焦显微镜技术［M］. 西安：第四军医大学出版社，2004：67.