蜂胶抗肿瘤活性成分的研究

【摘要】采用溶媒萃取法和硅胶柱层析法从蜂胶中获得了两种具有抗肿瘤活性的组分PPLCC和PPLSE,体外抗肿瘤细胞人肝癌细胞(HepG2)和人口腔癌细胞(KB)试验表明,浓度为50μg/ml的PPLCC和PPLSE对HepG2细胞的抑制率分别达87.4%和35.1%,IC50分别为17.5μg/ml和1151.2μg/ml;对KB细胞的抑制率分别为84.9%和59.8%,IC50分别为21.0μg/ml和33.6μg/ml。结果表明,蜂胶可作为抗肿瘤活性物质的天然来源。

【作者】 李沅庭1  周长林1  楼基伟2  林健2 (1中国药科大学生命科学与技术学院,江苏南京 210009   2上海美通生物科技有限公司,上海 200235)

【关键词】蜂胶 抗肿瘤活性

蜂胶(propolis)是蜜蜂采集植物的树脂与蜂蜡并混入其上顎腺分泌物等加工而成的一种树脂状物质,蜂胶含有大量的类黄酮(黄酮、黄酮醇和黄烷酮)、芳香酸脂族酸及其酯,以及萜烯类,具有抗细菌、抗真菌、抗病毒、抗氧化、消炎、麻醉等生物学和药理作用。此外,蜂胶对人体癌细胞株具有强烈的毒杀作用,如人肝癌细胞株HuH13、人口腔癌细胞株KB、人子宫颈癌细胞株Hela^[1]等,因而受到了医学界的广泛重视和深入研究。

蜂胶中具有抑制癌细胞的活性成分主要是咖啡酸类的衍生物,如咖啡酸苯乙酯(caffeicacid phenethylester,CAPE)。咖啡酸苯乙酯具有广泛的生物学活性,Su^[2]等研究结果表明,咖啡酸苯乙酯可选择性地抑制5型腺病毒畸变细胞中DNA的合成,在高浓度时可将畸变细胞杀死。同时,CAPE具有诱导受到致癌物质诱导转形的不正常细胞产生细胞凋亡^[3]和抗氧化作用^[4],动物实验研究表明,CAPE能够抑制脑类脂过氧化作用,减少脂质过氧物和脂褐素的形成与沉积。CAPE对肿瘤细胞具有细胞毒性,Grunberger^[5～7]等人的研究指出,CAPE能够抑制人乳腺癌、黑色素瘤和人多形态GBM18肿瘤细胞系的生长。同时,也是一种NO抑制剂。

由于咖啡酸苯乙酯的毒性大,其临床应用受到限制。本研究主要从蜂胶中提取含有咖啡酸衍生物和咖啡酸苯乙酯类似物的抗肿瘤活性成分,并对所得样品进行体外抗肿瘤活性研究,以期获得蜂胶来源的高效低毒的抗肿瘤活性成分。并采用柱层析法和溶媒萃取法提取到了蜂胶中的活性成分,为其临床应用奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 材料

蜂胶(深褐色不规则固体,表面有光泽,气微,味微甜);咖啡酸苯乙酯标准品(caffeicacidphen ethylester,CAPE)由上海美通生物科技有限公司提供;其他化学试剂均为国产分析纯。

1.2 提取方法

1.2.1 硅胶柱层析法蜂胶冷冻粉碎后溶于80%乙醇,浸泡2d,滤除不溶物及杂质,减压回收溶剂得蜂胶乙醇浸膏,浸膏用少量无水甲醇溶解,以硅胶(100～200目)吸附,用不同配比石油醚乙酸乙酯梯度洗脱,收集石油醚乙酸乙酯(8∶2)的洗脱部分。

1.2.2溶媒萃取法^[9]

蜂胶冷冻粉碎后溶于95%乙醇,浸泡2d,滤除不溶物及杂质,减压回收溶剂得乙醇浸膏,浸膏用热水温浸,搅拌悬浮,用石油醚抽提5次,水层及混悬物用氯仿抽提5次,得氯仿可溶物。

1.3提取产物的分析与鉴定

1.3.1薄层层析法 柱层析和溶媒萃取样品采用薄层层析法进行分析和鉴定,薄层层析固定相为硅胶G,展开剂为石油醚乙酸乙酯(7∶3),显色剂为2%FeCL3甲醇溶液。

1.3.2高效液相色谱法^[5] 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂,以甲醇乙腈四氢呋喃水(25∶35∶3.5∶36.5)为流动相,流速为1.0ml/min,紫外检测波长为328nm。

1.4体外抗肿瘤活性试验MTT法^[10]

检测提取样品对肿瘤细胞HepG2和KB的杀伤作用。取对数生长期的肿瘤细胞接种于96孔板中,设空白对照组5孔,阳性对照组(CAPE)与实验组设4个浓度,每浓度5孔。置37℃、5%CO2培养箱中培养12h后,空白对照组每孔加RP MI1640培养液20μl,实验组每孔加20μl药物。培养48h后加入MTT溶液(5mg/ml)20μl,培养4h后,弃去上清液,每孔加入DMSO150μl,振摇混匀。在DG5031型酶联免疫检测仪下测定各孔的A570值。抑制率(%)=(1A实/A对)×100%

2 结果

2.1 提取产物的分析

两种提取方法所得到的样品PPL CC和PPL SE用薄层色谱法检测,薄层色谱图如图1所示,其中CAPE的Rf值为0.36,PPL CC有2个明显斑点,Rf值为0.36和0.50,PPL SE有3个明显斑点,Rf值分别为0.36,0.50,0.60。

a:PPL SE;b:PPL CC;c:CAPEstandard Fig1TLCofCAPE,PPL SEandPPL CC

高效液相色谱法检测,CAPE的保留时间为7.4min,样品PPL CC7.5min和PPL SE7.5min均有峰在相同位置出现,表明两种方法收集到CAPE及其极性相近的物质。液相图谱如图2所示。

a:CAPEstandard;b:PPL CC;c:PPL SE;1CAPE Fig2HPLCchromatogramofCAPE,PPL SEandPPL CC

2.2体外抗肿瘤活性试验

PPL CC和PPL SE体外抗肿瘤活性试验结果见表1。

由表1可以看出,对HepG2细胞,CAPE标准品在48h,50μg/ml剂量组抑制率达到52.9%,半数抑制浓度为110.4μg/ml;PPL CC有3个剂量组(50μg/ml,10μg/ml,5μg/ml)对HepG2细胞有一定的抑制作用,3组抑制率差距较大,各组抑制率随用量增大而增大,在48h,50μg/ml剂量组抑制率达到87.4%,半数抑制浓度为17.5μg/ml,抑制效果高于CAPE标准品。PPL SE只在高剂量组(50μg/ml)有抑制作用,抑制率为35.1%,半数抑制浓度为1151.2μg/ml。对KB细胞,CAPE、PPL CC和PPL SE3种样品的抑制作用均较HepG2细胞明显,50μg/ml剂量组抑制率分别为61.2%,84.9%,59.8%,高于HepG2细胞。半数抑制浓度分别为34.3μg/ml,21.0μg/ml,33.6μg/ml。可见KB细胞对3种样品的敏感性更高。

3 讨论

PPL CC对HepG2细胞和KB细胞分别有3个剂量组表现出一定的抑制作用,各组抑制率随用量增大而增大,各剂量分别相当于蜂胶的量为2.7mg/ml(100μg/ml)、1.35mg/ml(50μg/ml)、0.27mg/ml(10μg/ml)、0.135mg/ml(5μg/ml)、0.027mg/ml(1μg/ml)。PPL SE在高剂量组对细胞抑制作用明显,各剂量分别相当于蜂胶的量为0.2mg/ml(100μg/ml),0.1mg/ml(50μg/ml),0.02mg/ml(10μg/ml),0.01mg/ml(5μg/ml),2×10-3mg/ml(1μg/ml)。由于柱层析方法可除去大量杂质,从而使有效成分含量提高,对肿瘤细胞显示较强的抑制作用,且抑制效果高于CAPE。提示该样品中几种组分合用可增强抗肿瘤活性,有进一步研究的价值。PPL SE为萃取所得,其中杂质较多,但同时我们也注意到,对HepG2细胞,50μg/mlPPL SE(相当于0.1mg/ml蜂胶)与5μg/mlPPL CC(相当于0.135mg/ml蜂胶)相比其抑制率要高;对KB细胞,100μg/mlPPL SE(相当于0.2mg/ml蜂胶)比10μg/mlPPL CC(相当于0.27mg/ml蜂胶)抑制率高,这表明样品PPL SE中含有其他不同于PPL CC的抗肿瘤活性组分,亦有待于进一步研究。

参考文献:

[1]MatsunoT,MatsumotoY,etal.IsolationandCharacteriza tionofCytotoxicDiterpenoidIsomerfromProppolis[J].Z Naturforsch,1997,52c:702.

[2]SuZ,GrunbergerD,FisherPB.SuppressionofAdenovirus Type5E1A MediatedTransformationandExpressionofthe TransformedPhenotypebyCaffeicAcidPhenethylEster(CAPE)[J].MolecularCarcinogenesis,1991,4:231.

[3]NomuraM,KajiA,MaW,etal.SuppressionofCell TransformationandInductionofApoptosisbyCaffeicAcid PhenethylEster[J].MolecularCarcinogenesis,2001,31:83.

[4]IrmakMK,FadilliogluE,SogutS,etal.Effectsofcaffeic acidphenethylesterandalpha tocopherolonreperfusioninju ryinratbrain[J].BiochemFunct,2003,Sep,21(3):283.

[5]GrunbergerD,BanerjeeR,EisingerK,etal.Preferential cytotoxicityontumorcellsbycaffeicacidphenethylesteriso latedfrompropolis[J].Experientia,1988,44:230.

[6]黄文诚.蜂胶的化学成分和生物学活性(二)[J].蜜蜂杂志,1998,7:12.

[7]NagaokaT,BanskotaAH,TezukaY,etal.Caffeicacid phenethylester(CAPE)analogues:potentnitricoxideinhibi torsfromtheNetherlandpropolis[J].BiolPharmBull,2003,26(4):487.

[8]UsiaT,BanskotaAH,TezukaYT,etal.Constituentsof ChinesePropolisandTheirAntiproliferativeActivities[J].J NatProd,2002,65(5):673.

[9]孙文基主编.天然药物成分提取分离与制备[M].北京:中国医药科技出版社.1999,444.

[10]司徒镇强,吴军正主编.细胞培养[M].北京:世界图书出版公司.2004,250.