国产蜂胶对肝癌细胞体外杀伤作用的研究

【摘要】采用MTT细胞毒实验分别测定不同浓度的国产蜂胶对体外培养人肝癌细胞株细胞的杀伤率,并与商业化标准蜂胶(Sigma#P_1010)比较。结果示国产蜂胶和标准蜂胶对肝癌细胞均有杀伤作用,且呈浓度-抑制率相关关系,而对正常细胞的影响较小。

【作者】 郭秀婵  叶梁  张永利  曾毅

【关键词】蜂胶 肝肿瘤 肿瘤 实验性 抗肿瘤 MTT

蜂胶是蜜蜂从各种植物中采集的树脂类物质的总称,其成分因其来源不同而不同,一般由50%的树脂和植物香脂、30%的蜂蜡、10%的芳香油、5%花粉和5%的其它物质以及一些有机物碎屑组成。在早期,尤其是欧洲,民间用它做为抗炎药物。蜂胶 ,尤其是醇提取的蜂胶有多种活性 ,包括抗细菌、抗真菌、抗病毒、护肝等效果,因此已广泛用于保健食品。此外 ,蜂胶还有抗氧化、抗细胞增殖、抗突变及免疫调节作用 ,又因为蜂胶富含黄酮醇、酚酸和萜类生物碱,因而具有潜在的化学预防作用^[1]。动物实验表明,蜂胶可抑制由化学致癌物诱发的肿瘤^[2,3]。为了研究国产蜂胶的抗肿瘤作用,我们以不同浓度的国产蜂胶在体外作用于人肝癌细胞,并与Sigma标准蜂胶比较,就其对肿瘤细胞的体外杀伤作用进行了研究。

１材料与方法

试验方法:用RPMI1640培养液将国产蜂胶稀释,稀释比从1:20开始,依次到1:5000备用;标准蜂胶先用无水乙醇溶解后,使用前再用RPMI1640培养液稀释到所用浓度;MTT用PBS稀释成0.25%,备用。HepⅡ肝癌细胞用RPMI1640完全培养液(含2mmol/L谷氨酰氨、100μg/ml链霉素、100μg/ml青霉素和10%的小牛血清)培养,当细胞数达到106左右时接种到96孔板,每孔加入1×104个细胞/50μl,细胞贴壁后,在对数生长期加入不同浓度的蜂胶分别作用8小时、24小时、96小时后,加MTT4小时后,倾去上清液,加入DMSO充分溶解形成结晶,用酶标仪读取(570nm),测OD值,以上实验均重复２次以上,并据对照细胞OD值,计算出抑制率,抑制率＝(对照组OD值-实验组OD值)/对照组OD值×100%;并绘制药物浓度抑制率曲线。

试验分组:①国产蜂胶组中设对照组和16个实验小组(每个小组12个孔,求其平均OD值);对照组只加培养液,16个实验小组分别加不同稀释度的蜂胶,浓度为1:100、1:200、1:300到1:1000，然后为1:1500、1:2000、1:2500到1:4000。②标准蜂胶组中设对照组和5个实验小组;后者含蜂胶浓度分别为50μg、100μg、150μg、200μg、250μg。③用接近半效应量的国产蜂胶作用于人正常二倍体上皮细胞,观察其在体外对正常细胞的影响。

国产蜂胶由北京好富欣生物工程技术有限公司提供,MTT(Thiazollblue)、标准蜂胶(Propolis)及二甲基亚砜(DMSO)购自Sigma公司。HepⅡ人肝癌细胞系由中国预防医学科学院病毒学研究所肿瘤室培养传代保存。其他试剂由中国预防医学科学院病毒学研究所配液室提供。

２结果

不同浓度的国产蜂胶在体外与肝癌细胞分别接触8小时、24小时后,计算抑制率,图1为不同浓度(从1:300到1:800)的蜂胶与肝癌细胞作用24小时的结果,高于1:300浓度的蜂胶几乎杀死所有的细胞,而低于1:800的浓度抑制作用不明显。图2为不同浓度Sigma标准蜂胶与肝癌细胞作用24小时的结果。两者作用8小时和24小时的结果相似。可见国产蜂胶与Sigma标准蜂胶对肝癌细胞有相似的抑制作用。

此外 ,癌细胞与蜂胶接触24小时,可见细胞变形,胞浆出现空泡,着色,核分裂象减少,细胞贴壁率下降;贴壁的细胞固缩,呈明显的凋亡状态,而同样浓度的蜂胶作用于正常人胚肾上皮细胞后,细胞形态无明显改变；说明该药物对肿瘤细胞有较强的杀伤作用,对正常细胞影响较小。因此，国产蜂胶对人肝癌细胞有较好的直接杀灭作用。

３讨论

目前,已经从蜂胶中分离出300多种成分,含有大量的黄酮类 ,萜烯类化合物是蜂胶的重要特征。很多黄酮类,萜烯类物质具有抗癌活性,尤其是多种倍萜类、二萜类、三萜类等化合物,是抗白血病、抗肿瘤的重要成分。研究表明,蜂胶中的咖啡酸、木脂类、多糖、甙类、皂甙、萘醌类等物质都具有抗肿瘤活性^[4],近年来有关蜂胶抗肿瘤的报道越来越多,尤其是日本和韩国学者做了大量的工作。我国的蜂胶生产是19世纪末由西方蜂种引进中国的,70年代有了较大进展 ,目前,我国已成为世界上蜂胶生产量最大的国家。由于放疗、化疗在杀伤肿瘤细胞的同时,也会损伤机体的免疫活性细胞及造血细胞,因此,强化机体免疫、对抗放疗、化疗引起的副作用,是当今肿瘤防治工作重要任务之一。大量研究表明,蜂胶是一种天然的免疫强化剂,同时又兼有抗肿瘤、抗病毒、抗菌的活性,韩国学者最近报道Sigma蜂胶（#1010）对人肿瘤细胞有明显的诱凋亡作用^[5]。为此我们同时用国产蜂胶和Sigma蜂胶作用于体外培养的人肝癌细胞,比较两者对癌细胞的抑制作用，实验结果表明,国产醇提取蜂胶对肝癌在体外有很强的杀伤作用,其1:400(浓度0.25%)稀释后与标准蜂胶100μｇ的作用相似 ,国产蜂胶和Sigma蜂胶作用肝癌细胞24小时后 ,没有脱落死亡的细胞呈明显凋亡形态。随着蜂胶浓度的增加,对癌细胞的杀伤作用也在增加。理想的抗癌药物是对癌细胞有选择性杀伤效应,而对正常细胞无影响或伤害很少。为此,我们选用ID50附近浓度(1:500和1:400蜂胶)作用于正常人胚肾二倍体细胞,结果表明对正常细胞影响较小。本试验为蜂胶抗肝癌效应提供了初步依据,要进一步证实蜂胶的体内抗肝癌效果,尚需做动物实验后才可作出综合判断。

参考文献：

[1] Kimoto N,Hirose M,Mayumi K,et al.Post-initiation effects of a super critical extract of propolis in a rat two-stage car-cinogenesis model in female F344 rats[J].Cancer letter,1999,147:221-227.

[2] Rao CV,Desai D,Smith B,etal.Inhibitory effect of caffeic acid esters on azoxy-methane-induced  biochemcial changes and abberrant crypt foci formation in ratcolon[J].Cancer Res,1993,53:4182-4188.

[3] Rao CV,Desai D,Rivenson A,et al.Chemoprevention of colon carcinogenesis by phenylethyl-3-methylcaffeate[J].Cancer Res,1995,55:2310-2315.

[4] 刘富海,许正鼎.神奇蜂胶疗法[M].北京:中国农业出版社,1998.54-65.

[5] Choi YH,Lee WY,Nam SY,et al.Apotosis induced by propolis inhuman hepatocellular carcinoma cell line[J].IntJMolMed,1999,4:29-32.