蜂王浆抗菌作用的研究

摘要：通过抑菌圈实验研究了不同处理的蜂王浆对细菌和真菌的抑菌效果。对蜂王浆进行了三种处理：RJ1(蜂王浆溶解于磷酸缓冲液)、RJ2(蜂王浆的水溶性成分溶液)、RJ3(经过加热处理后的王浆水溶性成分溶液)。研究结果表明：RJI、RJ2、RJ3均对革兰氏阳性菌枯草杆菌、金黄色葡萄球菌和藤黄八叠球菌有显著的抑制作用，表明蜂王浆中存在着耐热和不耐热的两类抗菌物质。RJ1和RJ2对大肠杆菌(革兰氏阴性菌)有显著的抑制作用，而RJ3对大肠杆菌没有明显抑制效果，说明王浆中含有可抑制大肠杆菌的多肽。对真菌的研究结果表明：蜂王浆对青霉、黑曲霉、面包霉和酵母等真菌没有明显抑制作用。

作者：孙亮先，陈朝阳，张昌松，张巧利(泉州师范学院模式生物研究中心，福建泉州362000)

蜂王浆是工蜂咽下腺和上颚腺分泌的饲喂蜂王和蜜蜂幼虫的一种白色或淡黄色黏稠浆状物。在蜂巢内。王台内的王浆可保存3天以上不变质，这一现象提醒人们王浆具有较强的抑菌作用。现已有证据证明王浆酸具有较强的抗菌消炎能力^[1-2]。Fujiwara(1990)和肖静伟等(1996)从蜂王浆水溶性蛋白中分离出分子量为5523Da和2.3kD的具有抗革兰氏阳性菌的活性肽^[3-4]。倪辉等(2003)从蜂王浆中提取了能抑制枯草芽孢杆菌但不能抑制大肠杆菌的小肽I51。根据已有实验数据，有理由推测蜂王浆中可能含有多种抗菌肽。为此，本研究对蜂王浆的抗菌谱进行系统研究，发现蜂王浆水溶性成分可抑制革兰氏阳性菌和部分革兰氏阴性菌(大肠杆菌)，但对真菌没有明显的抑制作用。本研究还揭示蜂王浆水溶性成分中含有耐热和不耐热的两类抑菌物质。本研究为蜂王浆的开发利用及从蜂王浆中分离新的抗菌肽提供了理论依据。

1、材料与方法

1.1材料

新鲜蜂王浆和供试菌株(枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、藤黄八叠球菌、黑曲霉、青霉、面包霉、酵母菌)由泉州师院模式生物研究中心提供。

1.2主要仪器和试剂

电子天平(0.0001g)，贝克曼落地式高速冷冻离心机(AvANTIJ一25)，LRH一250生化培养箱，大容量恒温振荡器等。

蛋白胨、牛肉浸膏为国产生化试剂；磷酸一氢钾、磷酸二氢钾、纯化琼脂粉、蔗糖、氯化钠皆为分析纯。

1.3方法

1.3.1蜂王浆上清液的制备

RJ1：取蜂王浆5g溶于10mL0．1mol／L磷酸缓冲液(pH7．0)，磁力搅拌均匀。

RJ2：取RJ1，4℃12000rpm离心30min，取上清液。

RJ3：取RJ1，沸水浴10min，冰水冷却，4~C12000rpm离心30min，取上清液。

1.3.2培养基制备

细菌用牛肉浸膏蛋白胨培养基，真菌采用PDA土豆培养基。

1.3.3菌悬液制备

将待试菌用适宜斜面活化，挑取单菌落于5ml相应的液体培养基中，以120r／min的转速摇床培养(细菌培养温度37℃，真菌28℃)12h。然后取菌悬液体积1O0LLl，用10倍无菌水稀释。

1.3.4抗茵活性测定

取直径6mm的圆形滤纸，于培养皿中121℃高压蒸汽灭菌30rain，干燥后在蜂王浆样品溶液中浸渍。取各种稀释过的菌悬液0．1nd于相应固体培养基平板上，用三角涂棒涂布均匀。将带有不同蜂王浆成分的滤纸片用无菌镊子轻贴于平板上，以缓冲液和100p．g／ml的氨卞青霉素作对照，放置于生化培养箱中(细菌于37℃培养箱中，真菌于28℃培养箱中)培养24h，测定抑菌圈大小^[2,5]。

1.3.5数据统计

采用Ducan法对样品的抑菌效果进行多重比较。

2、结果与分析

2.1蜂王浆对革兰氏阴性菌的抑制作用

本研究使用不同处理的蜂王浆对革兰氏阴性菌的代表菌种大肠杆菌进行了抑菌圈试验。试验结果显示(图1、表1)，RJ1和RJ2对大肠杆菌的生长均有一定的抑制作用，其抑菌效力大约相当于100~g／ml的氨卞青霉素的1／3；而RJ3则对大肠杆菌没有抑制效果。从成分上来看，RJ1是蜂王浆的悬浊液，而RJ2是将RJ1高速离心后所得的上清夜，所以不含王浆酸等酯溶性成分。从表1可见，RJ1的抑菌效力略高于RJ2，说明蜂王浆中含有可抑制大肠杆菌的酯溶性成分和水溶性成分。RJ3是将RJ2加热处理，经离心除去王浆中已经变性的多肽，所以RJ3不含有高分子量的蛋白分子。从RJ2可抑制大肠杆菌生长而RJ3不能抑菌的实验结果可以推断，蜂王浆中含有可以抑制大肠杆菌生长的多肽，而王浆中耐热性的水溶性成分则能不具有抑制大肠杆菌生长的特性。

2.2蜂王浆对革兰氏阳性菌的抑制效果

抑菌圈试验结果表明(图1、表1)，RJ1、RJ2、RJ3均对三种革兰氏阳性菌枯草杆菌、金黄色葡萄球菌和藤黄八叠球菌都有较为明显的抑制作用。从表1中可见，三种不同处理的王浆的抑菌效果为：RJ1>RJ2>RJ3。该结果说明王浆中含有三类可抑制革兰氏阳性菌的物质：酯溶性物质、多肽和耐热性的水溶性成分。

2.3蜂王浆对真菌的抑制效果

研究发现，三种不同处理的蜂王浆对黑曲霉、青霉、面包霉以及酵母等真菌均没有明显的抑制作用，之前倪辉等(2003)的研究结果与此类似。

3、讨论

本研究发现，蜂王浆对枯草芽孢、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、藤黄八叠球菌具有较为明显的抑制作用，而对于青霉、黑曲霉、面包霉、酵母等真菌没有抑制作用。根据表1中抑菌斑大小，通过卡方检验后发现，RJ1、RJ2对各种试验菌的抑制程度无显著差异，而RJ3则表现出差异显著，进一步利用多重比较中的Ducan法得出RJ3对细菌的抑制强弱为：金黄色葡萄球菌>枯草杆菌>藤黄八叠球菌>大肠杆菌。

已有报道蜂王浆水溶性蛋白中含有抗菌活性肽，但至今才发现两种：分子量5523Da的Royalisin和分子量2.3kD的活性肽^[3,4]。有理由相信，蜂王浆中存在新的抗菌多肽和小肽。本研究所用的RJ3中抗菌成分很有可能为小肽。为此，我们取RJ3 100ul，加入10ul 2mol／L的NaC1，经抑菌实验后，发现加盐与不加盐的抑菌活性无显著差异。取RJ3200l，以1mol／LNaOH调pH值至9.0以上，静置几分钟，然后再用1mol／LHC1将pH调低到4.0以下，检查经过酸碱处理的RJ3活性，发现其抑菌活性无显著变化。通过K13的耐强酸强碱性和耐盐性实验，基本可以确定RJ3中起抗菌作用的是抗菌肽。对王浆中所含有的新的抗菌肽进行分离并克隆相应基因无疑具有广阔的前景。

参考文献：

[1]吴长青，吴文胜．董爱茶．蜂王浆功能因子的研究现状[J]．蜜蜂杂志，2001，(11)：32—33．

[2]刘克武，杨守忠，葛绍荣，等．蜂王浆的抗菌活性研究[J]．蜜蜂杂志，200l，(2)：5—6．

[3]FUJIWARAS,IMAIJ,FUJIWARAM,et,Apotentantibacterialproteininroyaljelly[J].TheJournalofBiologicalChemistry,l990,265(19):ll333-ll337.

[4]肖静伟，王戎疆，李绍文，等．蜂王浆中一种有抗菌活性的小肽[J]．昆虫学报，1996，39(2)：133—14O．

[5]倪辉，吉挺，杨远帆．蜂王浆抗菌作用的初步研究[J]．蜜蜂杂志，2003，(2)：9—10.4.