蜂胶提取物抑菌活性及其抑菌机理的研究

摘要：制备蜂胶提取物，对5种食品中常见的致腐菌作抑菌实验，结果表明蜂胶提取物对G⁺菌的抑制效果好，对G-菌的抑制效果次之，对黑曲霉的抑制效果略差；pH值越低，蜂胶抑菌效果越好；Na⁺、Fe³⁺、Mg²⁺、Ca²⁺和K⁺对蜂胶的抑菌效果基本上无影响；过高的温度会使蜂胶的抑菌效果变差。选择G⁺、G^-各一种菌体添加蜂胶提取物，检测碱性磷酸酶和β-半乳糖苷酶，结果表明，蜂胶能使菌体细胞的通透性增强。

周先汉，张秀喜，朱稀檩，魏 巍，朱章俊 （合肥工业大学生物与食品工程学院，合肥230009）

关键词：蜂胶提取物；抑菌；最小抑菌浓度；机理

蜂胶是一种天然的活性物质，其成分极为复杂，含有黄酮类、萜烯类、酮类、酯类、醇类、酚类等物质。研究表明，蜂胶具有抑菌、抗氧化、抗病毒、抗溃疡、消炎、局部麻醉、调节血压和增强免疫力等生物学和药理作用，受到医学界的广泛重视^[1-2]。

一些研究表明，蜂胶提取物对革兰阳性菌的抑制效果较好^[3]。本文选取食品中5种常见致腐菌，考察蜂胶提取物的抑菌作用，确定其最小抑菌浓度；并利用碱性磷酸酶位于细胞壁和细胞膜间隙和β-半乳糖苷酶位于细胞膜内，不向细胞外分泌的特点，测定细胞壁和细胞膜的通透性，对蜂胶抑菌机理进行探讨，为蜂胶在食品保鲜方面的应用提供一定的依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 蜂胶水提取物用适量95%乙醇溶解原料 蜂胶(河南普瑞)，以水为介质回流提取，提取液4000r/min离心10min，旋转蒸发得蜂胶浸膏，烘箱干燥至恒质量得蜂胶提取物。将提取物溶于95%乙醇中，配制规定浓度的蜂胶溶液。

1.1.2 供试菌种枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、大肠杆菌(Escherichiacoli)、啤酒上层酵母(Saccharomycescerevisiae)、黑曲霉(Aspergillusniger)：合肥工业大学微生物实验室。

1.2 实验方法

1.2.1 最小抑菌浓度(MIC值)的测定

配制一定初始浓度的蜂胶溶液，按照一定规律依次降低，选择1.1.2所述的5种实验菌种，用牛津杯抑菌圈法，进行双层抑菌实验，测定抑菌圈的直径大小，直至没有抑菌圈出现，确定蜂胶溶液对该菌种的MIC值。

1.2.2 pH值对蜂胶提取物抑菌效果的影响

食品 pH值一般在3～8之间，因此，选择pH3、4、5、6、7、8六个水平，配制浓度为5mg/mL的蜂胶溶液进行抑菌实验。以啤酒上层酵母为实验菌种，同时做自然pH对照。比较抑菌圈大小，观察pH值对蜂胶抑菌效果的影响。

1.2.3 金属离子对蜂胶提取物抑菌效果的影响

选取食品中常见的金属离子Na⁺、Fe³⁺、Mg²⁺、Ca²⁺和K⁺，配成含蜂胶5mg/mL、金属离子0.1mol/L的蜂胶金属离子混合液，以啤酒上层酵母为实验菌种，同时做空白对照。比较抑菌圈大小，观察金属离子对蜂胶抑菌效果的影响。

1.2.4温度对蜂胶提取物抑菌效果的影响

将5mg/mL蜂胶溶液分别在65、80、100℃和121℃下处理30min，以啤酒上层酵母为实验菌种，同时做常温对照。比较抑菌圈大小，观察温度对蜂胶抑菌效果的影响。

1.2.5 蜂胶对细菌细胞壁通透性的影响

碱性磷酸酶位于细胞的细胞壁和细胞膜的间隙之中，在正常情况下不向外分泌，只有当细胞壁的通透性增大后，碱性磷酸酶才会释放到细胞体外^[4]。将大肠杆菌接入LB液体培养基中37℃培养24h，6000r/min于4℃下离心6min收集菌体。菌体中加入蜂胶溶液(浓度为10mg/mL)作用一定时间后，离心取上清液510nm下测吸光度，同时做不含菌蜂胶对照组。

1.2.6 蜂胶对细菌细胞膜通透性的

影响β-半乳糖苷酶位于细胞膜内，通常情况下不向细胞外分泌，只有当细胞膜的通透性增大后，β-半乳糖苷酶才会释放到细胞体外^[4]。选择大肠杆菌和金黄色葡萄球菌为实验菌种，操作同1.2.5，不做空白对照。

2 结果与讨论

2.1 最小抑菌浓度(MIC值)的测定

蜂胶浓度对各实验菌种的抑制效果及最小抑菌浓度(MIC值)见表1~表5。

从表1~表5可以看出，蜂胶提取物对5种供试菌的抑制效果强弱顺序为：酵母菌(MIC0.13mg/

mL)，枯草芽孢杆菌(MIC0.25mg/mL)，金黄色葡萄球菌(MIC0.3mg/mL)，大肠杆菌(MIC0.8mg/mL)，黑曲霉(MIC10.5mg/mL)。结果表明，蜂胶提取物对G+ 菌的抑制效果要好于G^-菌和霉菌。通过对G⁺ 、G^- 、酵母菌和黑曲霉的细胞结构及成分分析^[5-6]，初步推测，蜂胶的抑菌效果与菌体的细胞壁成分有较大关系，在蜂胶作用下，细胞壁通透性可能发生改变， 从而导致蜂胶中的有效成分进入细胞内，达到抑菌目的。

2.2 不同pH值对蜂胶溶液的抑菌效果

由图1可知，pH值越小，蜂胶的抑菌效果越好，pH达到8.0时抑菌效果下降较明显。大多数细菌生长的最适pH值在7，酸性条件不利于细菌的生长(少数嗜酸菌除外)。故在较低的pH值更有利于蜂胶抑菌效果的发挥。

2.3 含0.1mol/L不同金属离子蜂胶溶液的抑菌效果 含0.1mol/L不同金属离子对蜂胶液的抑菌效果影响见图2。

由图2可知，不同金属离子对蜂胶抑菌效果的影响不明显。食品中上述金属离子通常远低于实验浓度，可见，上述常见金属离子对蜂胶提取液在食品中的抑菌效果不会产生明显影响。

2.4 不同温度处理后蜂胶溶液抑菌效果

由图3可知，温度对蜂胶提取物的抑菌效果有较大影响，这主要是由于蜂胶中的主要抑菌成分为黄酮和树脂类物质，而黄酮类物质的热稳定性较差，从而直接导致其抑菌效果急剧下降。由图3显示，65℃到80℃的巴氏杀菌温度对蜂胶液的抑菌效果影响不大，经过121℃高温处理后，蜂胶液仍具有抑菌效果，这说明蜂胶中的抑菌物质除黄酮和树脂类物质外，还有其他耐高温组分，这为蜂胶应用于需要高温杀菌的流质食品提供了可能性。

2.5蜂胶提取物对细菌细胞壁通透性的影响

大肠杆菌胞外碱性磷酸酶活性检测结果见图4。

由图4中大肠杆菌吸光度曲线可知，大肠杆菌的吸光度比对照组有较大的提高，随着作用时间的延长逐渐增大，60min以后趋于不变。可能是因为开始时随着黄酮类物质的消耗，碱性磷酸酶溶出量不断增加，随后由于蜂胶中抑菌成分反应完全或者菌体与蜂胶液反应完全，碱性磷酸酶的溶出量较大并趋于稳定。

2.6 蜂胶提取物对细菌细胞膜通透性的影响

蜂胶处理后两种细菌胞外β-半乳糖苷酶活性检测结果见图5。

由图5可知，被测液中β-半乳糖苷酶含量逐

渐增大最后趋于不变，可知蜂胶液对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的细胞膜通透性均有增强作用。比较两条曲线可知，蜂胶提取物对G⁺菌的细胞膜作用强于对G^-菌细胞膜的作用。

造成G⁺和G^-菌β-半乳糖苷酶溶出量差距较大的原因，可能是由于这两种细菌细胞壁成分的不同，即G+细胞壁对蜂胶提取物中的有效成分较为敏感，其通透性在蜂胶的作用下增大较快，使细胞膜的通透性增强，从而达到破坏菌体结构、抑制细菌生长的目的，而G^-菌的细胞壁对蜂胶提取物的敏感程度要低。分析两种不同菌的细胞壁成分可以推测，蜂胶中的有效成分对细胞壁的作用主要是体现在对肽聚糖的作用上，即蜂胶提取物中可能存在促使肽聚糖水解的物质。

3 结论

蜂胶对5个供试菌种均有较好的抑制效果，可见蜂胶具有广谱抑菌性。 较低的pH值有利于蜂胶发挥抑菌作用；温度高于常温时，蜂胶的抑菌活性有所降低，但在常规的杀菌温度范围内，仍有较好的抑菌效果且较为稳定；金属离子对蜂胶的抑菌效果影响不大。 蜂胶对细菌细胞壁与细胞膜都有一定的作用，使其通透性增加，造成细胞内物质外流，破坏了细胞正常代谢的物质基础，从而达到了抑菌效果。

参考文献：

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[6]沈平.微生物学[M].北京:高等教育出版社,2000:27-33