蜂胶对不同龋敏感者变形链球菌临床分离株产酸影响的体外实验研究

【摘要】 目的 研究蜂胶提取物对不同龋敏感者口腔变形链球菌临床分离株的产酸能力的影响。方法 以BHI液体培养基为溶剂,分别配制pH=7.0的5 g/L 和1.25g/L水溶性蜂胶溶液,1.5625 g/L醇溶性蜂胶溶液,并以空白液体培养基作为对照,加入高龋组，无龋组，国际标准株变形链球菌，厌氧培养48 h 后离心,用精密酸度仪测定上清的pH值，计算出△pH，并进行比较。结果 高龋组和国际标准株产酸能力明显高于无龋组；醇溶性蜂胶溶液和水溶性蜂胶溶液皆可使变链菌产酸能力降低,蜂胶各组与对照组相比差异均有统计学意义(P< 0.05) 。醇溶性蜂胶溶液和5 g/L 水溶性蜂胶溶液降低产酸能力的作用比较差异无统计学意义(P> 0.05)，但是均明显高于1.25g/L水溶性蜂胶溶液；蜂胶对高龋组和无龋组细菌的影响没有显著性差异。结论 蜂胶提取物影响变形链球菌的代谢,使变形链球菌产酸能力降低。

【作者】 曾学宁   达州市中心医院 口腔科 635000

【关键词】 蜂胶; 变形链球菌; 龋敏感；产酸

龋病是世界范围内的常见病和多发病，其发病率高，危害性大，被世界卫生组织列为要重点防治的三大疾病之一^[1]。变形链球菌（变链菌）是公认的主要致龋菌之一。近年来对蜂胶的研究比较多，本实验通过观察蜂胶对不同龋敏感患者口腔变形链球菌临床分离株产酸的影响，从而探讨蜂胶作为一种生物防龋制剂的可行性，为其临床使用提供实验依据。

1  材料和方法

1.1  材料  蜂胶：乐山某集团提供。细菌: 自行分离、鉴定自不同龋敏感患者口腔中的变形链球菌63株，其中高龋组34株，无龋组29株（高龋者dmft≥6，无龋者dmft＝0）。
国际参考菌株变形链球菌（S．mutans）ATCC 25175（血清型C），由四川大学华西医学院口腔生物工程重点实验室提供。

1.2  菌液的制备  将甘油保种变形链球菌临床分离株与国际标准株分别接种于MS固体培养基，37℃，微需氧复苏48h，检查生长状况，镜检鉴定无污染后，挑取单个菌落转种于BHI 液体培养基增菌，厌氧（80%N2、10%H2、10%CO2）培养24h，涂片检查为纯培养后，将菌液在4℃下以3000r／min离心15min，弃上清，收集细菌，无菌生理盐水洗菌两次，用无菌生理盐水调整为于紫外分光光度计540 nm处吸光度A=1.0的菌悬液，备用。

1. 3  试剂的制备  以pH为7.0的BHI 培养基为溶剂，配制醇溶性蜂胶溶液(1.5625g/L)，水溶性蜂胶溶液(5g/L 和1.25g/L)，调定各培养基的pH值为7.0 。

1. 4  实验方法  实验为4组：5 g/L蜂胶水溶液组，1.25 g/L蜂胶水溶液组,1.5625 g/L蜂胶醇溶液组，BHI培养液组做为对照。取各菌株的菌悬液，按菌液与液体培养基1∶10 (v/v) 比例接种细菌，37℃厌氧培养（80%N2、10%H2、10%CO2）48 h， 3000rpm，离心15 min，收集上清,采用 pHS - 3C精密酸度计，测定培养物上清的终末pH 值,并计算pH的变化值△pH值（初始pH 值－终末pH 值）。

1. 5  统计学方法  采用SPSS 11.0统计软件中的two-way ANVOA对不同细菌的产酸能力即△pH值，进行统计分析(а=0.05)；并采用kendall相关分析法检测蜂胶与细菌产酸能力之间的相关性。

2  结果

蜂胶对变链菌产酸能力的影响结果见表1。

细菌F=65.832，Ｐ＜0.05，培养基F=98.01，Ｐ＜0.05，细菌与培养基的交互性F=1.192，Ｐ＞0.05。

统计分析得出：无论添加蜂胶与否，国际标准株和高龋组变链菌的产酸能力没有显著性差异，但是它们的产酸能力均高于无龋组变链菌的产酸能力(P<0.05)；醇溶性蜂胶溶液和水溶性蜂胶溶液均可使变形链球菌产酸能力显著性降低（P<0.05）；1.5625 g/L醇溶性蜂胶溶液和5 g/L 水溶性蜂胶溶液降低变链菌产酸能力的作用均明显大于1.25 g/L水溶性蜂胶溶液(P<0.05) ；1.5625 g/L醇溶性蜂胶溶液与5 g/L 水溶性蜂胶溶液降低变链菌产酸能力的作用相比，其差异无统计学意义；蜂胶与变链菌之间没有交互性，这说明在本实验限定的条件下，蜂胶对高龋组变链菌产酸能力的影响和对无龋组变链菌产酸能力的影响相比没有明显的差异。

采用kendall相关分析法得出：kendall等级相关系数为-1.0，Ｐ值为0.042＜0.05，说明蜂胶与变链菌的产酸能力成负相关。因此可以可以得出蜂胶可以抑制变链菌的产酸能力。

　　3  讨论

蜂胶是一种天然活性物质，具有十分广泛的生物学作用，成为近年来国内药理学领域研究的一个热点。蜂胶中含有大量黄酮类、芳香酸、脂肪酸及萜烯类化合物，具有广谱抗菌作用。实验表明，蜂胶对革兰阳性细菌的抗菌作用较革兰阴性细菌为强^[2]。

变形链球菌是一种革兰氏阳性兼性厌氧菌，它能产生有机酸，使牙体硬组织发生无机物的酸蚀脱矿，有机物崩解，最终导致龋病的发生^[3]。对于蜂胶的防龋作用已有一些报道。Koo 等^[4]报道蜂胶醇溶液对口腔中10种细菌皆有抑菌作用,特别提出蜂胶醇溶液对变形链球菌和远缘链球菌的抑菌作用很强；王晶等^[5]研究得出醇溶性蜂胶溶液和水溶性蜂胶溶液都可以使变形链球菌产生的乳酸量显著减少。

本实验得出蜂胶醇溶液和水溶液均可以使变形链球菌的产酸能力降低，这与参考文献中的结果一致。高龋组细菌产酸能力高于无龋组的细菌，可能是因为高龋组存在着产酸能力强的菌株。但是蜂胶对于高龋组和无龋组的细菌的影响没有显著性差异，这说明蜂胶对不同菌株产酸作用的抑制机制可能都是一致的。蜂胶做为一种生物防龋材料，是具有可行性的，但是蜂胶的化学成分随产地和蜜蜂种类不同而异，具有高度的复杂性和多样性，对于蜂胶抑制变链菌产酸的具体机制、蜂胶的其他防龋性能以及不同蜂胶之间防龋能力的差异性，还需要进一步研究。

【参考文献】
［１］ Balakrishnan M，Simmonds RS，Tagg JR. Dental caries is a preventable infectious disease. ［Ｊ］Aust Dent，2000; 45(4):235～245.

［２］ 齐冬梅．蜂胶的药理作用和临床应用［Ｊ］．首都医药，2008，15（4）：44～45.

［３］ 岳松龄主编现代龋病学［Ｍ］．北京：北京医科大学中国协和医科大学联合出版社，1993.63～88.

［４］ Koo H. In vit ro antimicrobial activity of propolis and arnica montana against pathogens［Ｊ］.Arch Oral Biol，2000 ，45 :141～148.

［５］ 王晶,李玉晶,葛丽华等. 蜂胶对变形链球菌产酸的影响［Ｊ］ 首都医科大学学报，2006，27(3)：302～303.