蜂胶抗衰老机理初探

【摘要】探讨蜂胶对高龄小鼠抗衰老机理。以自然衰老小鼠为模型,分别用20,33,80 mg/kg剂量的蜂胶给小鼠灌胃24 d,MTT法观察脾脏淋巴细胞增殖;乳酸脱氢酶法(LDH)观察脾脏NK细胞及腹腔MΦ细胞对YAC-1的杀伤活性;胸腺细胞增殖法观察脾脏淋巴细胞IL-2及腹腔MΦ细胞IL-1的活性水平;采用化学比色法观察小鼠脑组织丙二醛(MDA)的含量和超氧化物歧化酶(SOD)的活力。试验结果表明,不同剂量蜂胶均可以提高小鼠抗氧化及免疫功能,其中中剂量蜂胶(33 mg/kg)明显提高小鼠脾脏淋巴细胞增殖(P<0.01)和NK细胞、Mφ细胞杀靶活性(P<0.01);同时,IL-1和IL-2产生也明显增加(P<0.01);丙二醛(MDA)的含量降低(P<0.01);超氧化物歧化酶(SOD)的活力显著增加(P<0.01)。适量剂量蜂胶具有明显提高高龄小鼠抗氧化及机体免疫功能的作用。

【作者】 庞美霞  王伟

【关键词】蜂胶 抗氧化 抗衰老机理

蜂胶是蜜蜂采集白杨、白桦、榕树等嫩芽的腋芽和花蕾及独特的树脂类物质,归巢后与其舌腺分泌物混合并反复加工转化而成的一种胶黏物质。中国学者发现蜂胶的醇提取物含有多种营养成分:丰富的黄酮类化合物,达12.84 g/100g;高含量的脂肪酸,其中以不饱和类为主,占总量的57.90%;含有钾、钙、磷等多种矿物元素^[1]。近年来,对蜂胶的保健作用和药用价值研究日益增多。研究发现,蜂胶具有调节血糖、抗菌、抑制病毒等效应。对心血管系统有保护作用,且具保肝、泻下等作用。还具有止咳祛痰、解痉作用,并能提高机体免疫功能,抑制肿瘤细胞增殖^[2]。随年龄增长免疫功能衰退或紊乱是老年机体对传染性疾病、肿瘤、自身免疫性疾病易感的重要因素,老年机体一般表现为免疫功能低下^[3]。通过对衰老动物系统试验,探讨蜂胶对高龄小鼠抗衰老机理。

1 材料与试剂

1.1 试验动物

Balb/c小鼠:体重(28±2)g,20月龄;体重(24±1)g,7月龄,全部雄性,SPF级(河北医科大学实验动物学部提供)。

1.2 试验试剂

蜂胶湖北随州某蜂产品有限公司提供;MDA测定试剂盒、SOD测定试剂盒、双缩脲蛋白标准试剂盒均购自南京建成生物工程研究所;刀豆蛋白、MTT均为Sigma产品。

2 试验方法

2.1 动物分组

将高龄(20月龄)balb/c小鼠随机分为4组,每组10只:高龄对照组(蒸馏水灌胃0.3 mL/只);低剂量试验组(蜂胶灌胃20 mg/kg体重);中剂量试验组(蜂胶灌胃33 mg/kg体重);高剂量试验组(蜂胶灌胃80 mg/kg体重);7月龄balb/c小鼠作为低龄对照组(蒸馏水灌胃0.3mL/只),每天1次,连续28 d。

2.2 NK细胞杀靶试验

以YAC-1作为靶细胞,按乳酸脱氢酶(LDH)释放法进行。NK细胞活性按下式计算:NK细胞活性=(试验组OD570-自然释放组OD570)/(最大释放组OD570-自然释放组OD570)×100%

2.3 Mφ细胞吞噬功能的检测———LDH法

2.3.1 小鼠腹腔Mφ细胞的制备

于试验前一天给小鼠腹腔注射1%淀粉溶液1 mL,次日将小鼠摘眼球放血处死,向腹腔内注射无菌GKN,轻轻按摩腹部后,吸出灌洗液于无菌试管中,1 500 r/min离心10 min,弃去上清液,用10%NCSDMEM调整细胞浓度为5×106个/mL,备用。

2.3.2 腹腔Mφ细胞吞噬功能的检测

同NK细胞杀靶试验。Mφ细胞活性按下式计算:Mφ细胞活性=(试验组OD570-自然释放组OD570)/(最大释放组OD570-自然释放组OD570)×100%

2.4 淋巴细胞增殖试验

采用MTT比色法。常规制备小鼠脾淋巴细胞悬液。每样本设ConA刺激组和对照组,各设3个重复孔,放置于37℃、5%CO2的饱和水气CO2细胞培养箱中培养72 h,在培养结束前4~6 h弃去上清液,每孔加入10μL的MTT(5 mg/mL溶于PBS中,滤过除菌,4℃保存)和90μL的PBS,继续培养4 h后,每孔加入150μL 10%的SDS,37℃保温1 h以上,用酶联检测仪在570 nm下测定OD值,以刺激指数(SI)作为判断淋巴细胞增殖的程度。SI=试验孔的OD570nm值/对照孔OD570nm值。

2.5 IL-1的诱生和测定

将上述已制备好的5×106个/mL小鼠腹腔Mφ细胞悬液加入终浓度为10μg/mL的LPS,置37℃,5%CO2的饱和水气CO2细胞培养箱中培养48 h,取培养细胞上清备用。测定方法采用小鼠胸腺细胞增殖法。取6~8周龄的C57BL/6小鼠,无菌分离单个胸腺细胞,以含5%小牛血清和2.5×10-5mol/L的2-巯基乙醇的培养基悬液细胞调整至1×106个/mL。用Mφ细胞培养液稀释待测样品(1∶8),每一样品设3个复孔,加样为50μL。并设两组对照:空白对照组(用培养基代替待检品)和ConA对照组(加入50μL亚刺激量的ConA,1μg/mL),置37℃,5%CO2的饱和水气CO2细胞培养箱中培养72 h,培养结束前4 h吸出培养上清,每孔加入10μLMTT和90μL PBS继续培养至试验结束。用酶联检测仪在570 nm波长处测定OD值。

2.6 IL-2的诱生和测定

将5×106个/mL的脾淋巴细胞悬液1 mL加入到24孔细胞培养板中,加入终浓度为5μg/ml的ConA,在37℃,5%CO2的饱和水气CO2细胞培养箱中培养24 h,收集上清液,备用。IL-2活性测定法采用C57BL/6小鼠胸腺细胞增殖法。以含5%血清的RPMI-1640培养液调整C57BL/6小鼠胸腺细胞至5×106个/mL,加入终浓度为1×10-6mol/L的氢化可的松。然后每孔加入待测样品100μL(1∶8)稀释。设两组阴性对照:空白对照组(用培养基代替待检品)和ConA对照组,置37℃,5%CO2的饱和水气CO2细胞培养箱中培养72 h,同上述MTT法。

2.7 小鼠脑中MDA的测定

将小鼠摘眼球放血处死,取脑,制成10%的脑匀浆,考马斯亮兰法测定蛋白质的含量,按MDA试剂盒所示的操作测定其含量。MDA含量(nmol/mgprot)=(OD测-OD空白)/(OD标准-OD空白)×标准品浓度/蛋白含量(mgprot/mL)

2.8 小鼠脑中SOD的测定

将小鼠摘眼球放血处死,取脑,制成1%的脑匀浆,考马斯亮兰法测定蛋白质的含量,按SOD试剂盒所示的操作测定其活性。

SOD活力(NU/mgprot)=(OD对照-OD测定)/OD对照/50%×反应液体积/取样量/蛋白含量(mgprot/mL)

3 试验结果

3.1 NK细胞杀靶和Mφ细胞吞噬功能

NK细胞与Mφ细胞均为体内非特异性免疫应答细胞,是机体免疫应答的第一道防线,NK细胞活性与Mφ细胞吞噬功能可以直接反映机体非特异性免疫应答的水平。NK细胞是一种特殊的淋巴细胞系,杀伤细胞不用预先致敏,NK细胞对靶细胞的杀伤作用表现为一种速发效应,与靶细胞混合后4 h内即发挥杀伤效应,可以杀伤并溶解体内的肿瘤细胞和侵入机体的细菌^[4]。Mφ细胞是另一种重要的非特异性免疫杀伤细胞,激活的Mφ细胞能识别和杀伤肿瘤细胞和感染细胞而不影响正常细胞的功能^[5],所以能增强Mφ细胞活性的药物可对整个机体的免疫系统起增强作用。试验结果表明三个剂量的蜂胶均可明显提高高龄小鼠的NK和Mφ对YAC-1的杀伤活性,其中中剂量效果最为显著,结果见表1。

 

表1蜂胶对NK细胞活性和Mφ细胞吞噬活性的影响

Tab·1 Effect of proplis on the activityof NK cells and macrophage

注:表中数据右肩*表示与高龄对照组相比P>0.05,表中数据右肩***表示P<0.01

3.2 淋巴细胞增殖试验淋巴细胞对丝裂原的增殖活性可以直接反映淋巴细胞的功能水平,ConA刺激可以反映机体T细胞介导的免疫应答水平。试验表明不同浓度的蜂胶均可显著促进脾脏淋巴细胞转化率(P<0.01),结果见图1。低、中、高剂量组小鼠与高龄对照组相比均有显著性差异(P<0·01);中、高剂量组小鼠与低龄对照组相比均无显著性差异(P>0·05)。

图1 蜂胶对淋巴细胞增殖活性的影响

Fig·1 Effect of proplis on the lymphocytes proliferation

注:图中数据右肩表示与高龄对照组相比:△P<0·01;与低龄对照组比,★P>0·05,★★0·01<p<0·05

3·3 il-1和il-2的检测

大多数老年机体存在免疫低下或紊乱的表现。尤以t细胞受损最为明显,il-2是t细胞分泌的主要因子,其作为免疫增强因子之一已被广泛认同,目前是被用来检测免疫功能高低、免疫衰老的重要指标之一。il-1的生物活性也及其广泛,在免疫系统几乎作用于所有免疫细胞。其中之一能辅助th细胞产生il-2,以及增加t细胞表面il-2的表达。已有报道,老年机体il-2产生能力的下降部分归因于巨噬细胞il-1产生的减少^[6-7]。试验表明给高龄小鼠灌胃不同浓度的蜂胶后,均可明显提高高龄小鼠腹腔mΦ细胞和脾淋巴细胞的il-1和il-2的活性,以33mg/kg剂量的蜂胶最显著,结果见表2。

表2 蜂胶对il-1和il-2活性的影响

Tab·2 effect of proplis on the activity il-1 and il-2

注:表中数据右肩表示与高龄对照组比,*0·01<P<0·05,***P<0·01

3·4 mda和sod测定

衰老是多因素综合作用的结果,其中自由基在衰老的发生、发展中具有重要的作用。自由基是一类具有高度活性的物质,能使核酸的主键断裂,使透明质酸降解及脂质发生过氧化^[8]。

表3 蜂胶对mda含量和sod活力的影响

注:表中数据右肩表示与高龄对照组相比,*P=>0·05,**0·01<P<0·05,***P<0·01

目前认为，自由基是引起衰老，心血管疾病，肿瘤，炎症等疾病的重要原因，其对机体的损伤程度可通过脂质过氧化的降解产物-MDA含量间接推断。SOD是生物体内超氧化物歧化酶，其作用主要是清除体内的自由基，对需氧生物体起保护作用^[9]。高龄小鼠灌服不同剂量蜂胶后，对其脑组织的MDA含量（nmol/mgprot）和SOD活力（NU/mgprot）也有明显影响，使MDA含量明显降低，SOD活力增加，结果如表3.

4.结论

适量蜂胶可以提高高龄小鼠免疫力低下的NK细胞活性和Mφ细胞活性。蜂胶可以提高高龄小鼠免疫力低下的淋巴细胞的增殖。蜂胶可以提高老龄小鼠的il-1和il-2。适量蜂胶可以明显降低MDA含量，提示其具有较强的清除活性氧自由基作用。蜂胶可明显降低SOD活性，提示其具有较强的清除活性氧自由基，抗氧化作用，因此推测，蜂胶具有较强的清除自由基作用，可能与其明显提高抗氧化酶活性有关。

参考文献：

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