蜂胶及蜂胶奥硝唑合剂体外抑制牙龈卟啉单胞菌生长的实验研究

【摘要】目的研究蜂胶及蜂胶奥硝唑合剂对牙龈卟啉单胞菌生长的影响。方法采用液体稀释法测定蜂胶对牙龈卟啉单胞菌的最小杀菌浓度(MBC);采用纸片扩散法观察蜂胶对奥硝唑体外抑制牙龈卟啉单胞菌生长的影响,并对结果进行统计学分析。结果蜂胶对牙龈卟啉单胞菌的MBC为0.156%,相当于0.125mg/L~0.25mg/L的奥硝唑。单独蜂胶药敏片对牙龈卟啉单胞菌的抑菌效果不理想,但蜂胶和奥硝唑联合应用后,10%蜂胶组的抑菌环大小均大于对应浓度的单独奥硝唑组,5%与2.5%蜂胶组在奥硝唑低浓度时的抑菌环大小也大于对应浓度的单独奥硝唑组。随着蜂胶浓度的增加,抑菌环增大。析因分析结果表明,蜂胶与奥硝唑对牙龈卟啉单胞菌的生长抑制作用存在交互作用(P<0.001)。结论蜂胶对牙龈卟啉单胞菌的生长有较好的抑制作用,并能够增强奥硝唑的体外抗菌活性;蜂胶作为天然抗生素,在牙周病治疗领域,具有较高的深入研究价值。

【作者】 蒋琳  林居红  刘明方  朱珠

【关键词】蜂胶 奥硝唑 牙龈卟啉单胞菌

牙周病是牙周组织炎症性疾病,菌斑细菌及其产物是引发牙周病必不可少的始动因子。牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingival.P.gingival.Pg)是牙周病、尤其是成人慢性牙周炎病变区域活动部位最主要的优势菌,而健康龈沟内很少,牙龈卟啉单胞菌的存在与牙周炎在治疗后复发或病情继续加重有关^[1]。一种良好的牙周病治疗药物必须具有良好的抑菌作用。

蜂胶作为民间药物,在中外都具有悠久的应用史。近年来蜂胶对口腔病的防治作用受到人们的关注。本研究通过药敏实验,了解蜂胶及蜂胶奥硝唑合剂对牙龈卟啉单胞菌的生长抑制效果,为蜂胶在牙周病治疗方面的开发利用提供理论依据。

资料和方法

1.实验药物:水溶性固体蜂胶:由河南某蜂业有限公司提供,纯度达98%,黄酮含量≥14,含铅<1ppm。奥硝唑原药:由西安博华制药有限公司提供,纯度达99%。

2.实验菌株:牙龈卟啉单胞菌(Pg)ATCC33277由四川大学华西口腔医学院生物医学工程教育部重点实验室提供。

3.培养基:液体培养基:采用牛心脑浸液培养基(BHI培养基),高压灭菌20min后备用。使用时添加Vitk1-Hemin液(1%)。固体培养基:采用BHI培养基添加琼脂(2g/ml),高压灭菌20min后冷却备用。使用时加入脱纤维蛋白血(5%~10%)即成BHI血琼脂培养基,倾注使用。

4.菌液的制备:菌冻干株经复苏、增菌、形态学检查及生化鉴定为纯培养后。采用麦氏比浊法用BHI液体培养基配成细菌混悬液(106~107CFU/mL)备用。

5.液体稀释法测定蜂胶与奥硝唑对Pg的MBC:用BHI+Hemin液体培养基按试管2倍稀释法将蜂胶稀释成以下浓度:10、5、2.5、1.25、0.625、0.313、0.156、0.078%。以同样的方法将奥硝唑稀释成以下浓度:256、128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25、0.125、0.0625、0.0313mg/L。每个试管加入0.5mL标化的菌液。将每个试管的培养液划线接种于BHI血琼脂平板上,每种浓度重复3次。经厌氧培养48h无细菌生长的最低药物浓度为MBC。设立阴性对照组、阳性对照组。

6.纸片扩散法测定蜂胶奥硝唑合剂对Pg的体外抑制作用:药敏片的制备:选择吸水性强的国产新华1号滤纸,用打孔器打成直径为6mm的圆形小纸片,装于洁净干燥的玻璃平皿内,经15~20分钟高压消毒后,放在40℃恒温箱中数天,使完全干燥。药物浓度的配制:奥硝唑原药溶于蒸馏水配成0.05%、0.04%、0.03%、0.02%和0.01%五个浓度的稀释溶液;水溶性固体蜂胶溶于蒸馏水,过滤除去杂质,配成10%、5%和2.5%三个浓度的溶液;蜂胶与奥硝唑溶液配合制成合剂,各合剂浓度如下。①蜂胶奥硝唑合剂1:蜂胶浓度为10%,奥硝唑浓度为0.05%、0.04%、0.03%、0.02%、0.01%;②蜂胶奥硝唑合剂2:蜂胶浓度为5%,奥硝唑浓度为0.05%、0.04%、0.03%、0.02%、0.01%;③蜂胶奥硝唑合剂3:蜂胶浓度为2.5%,奥硝唑浓度为0.05%、0.04%、0.03%、0.02%和0.01%。抗菌药敏片的制备:在超净台中,每张纸片滴加10μl上述不同浓度的药液,每种药物不同浓度的药敏片制作数张,分别放入清洁干燥的青霉素空瓶中,瓶口以单层牛皮纸包扎,采用真空干燥,后置于冰箱密封保存,备用。药敏实验:在无菌条件下,用划线法将Pg接种到血琼脂培养基平皿内。然后将制备好的各种药敏片(包括单一奥硝唑药敏片、合剂药敏片)用无菌摄子贴在90mm的平皿内,每个平皿内按一定距离贴五张药敏片,两纸片距离大于24mm,纸片与平皿边缘距离大于15mm。37℃厌氧(80%N2,10%H2,10%CO2)培养48h,观察结果,并测得每一药敏片的抑菌环直径。

7.统计分析:用SAS9.0对实验结果进行处理,对各组间进行析因分析。

结果

1.液体稀释法测定结果发现,含有蜂胶的培养液厌氧培养Pg48h后,蜂胶浓度≥0.156%的划线区域,无细菌生长,而含有0.078%蜂胶的培养液划线区域,看见Pg生长菌落,表明蜂胶对Pg的MBC为0.156%。同时,结果还发现奥硝唑对Pg的MBC为0.125~0.25mg/L。

2.蜂胶及合剂对Pg的抑菌实验结果见表1和表2。单独蜂胶药敏片对Pg的抑菌效果不理想,10%蜂胶的平均抑菌环大小仅为10.25mm;但蜂胶和奥硝唑联合应用后,合剂1组的抑菌环大小均大于对应浓度的单独奥硝唑组,合剂2与合剂3在奥硝唑低浓度时的抑菌环大小也大于对应浓度的单独奥硝唑组。随着蜂胶浓度的增加,抑菌环增大。析因分析结果表明,蜂胶与奥硝唑对Pg的生长抑制作用存在交互作用(P<0.001)。

讨论

近年来由于口腔微生物学研究的不断深入,口腔细菌与口腔常见疾病:龋病、牙周病、冠周炎等的密切关系已被证实。其中有关牙龈卟啉单胞菌与牙周炎的相关性研究已有较长的历史。目前大量研究发现,Pg在成人牙周炎中检出率最高,并在成人牙周炎患者血清中检出升高的特异性抗体,故Pg被认为是成人牙周炎的主要可疑病原菌^[2]。

自1890年W.D.Miller提出细菌感染是牙周病的病因,并建议用抗菌剂来治疗或减少菌斑以来,关于牙周病的药物治疗已有很大的发展^[1]。针对牙周致病菌的药物及其制剂越来越多。蜂胶是一味中药,已载于《中华本草》第九卷,化学成分非常复杂,到目前为止在蜂胶中发现的化学成分已经超过200多种^[3]。上个世纪开始,国内外学者就将蜂胶作为一种牙周病治疗药物进行研究,发现蜂胶对需氧菌、兼性厌氧菌、专性厌氧菌具有广泛的抑菌作用^[4,5],但蜂胶作为一种牙周病治疗药却没有在临床上得到推广应用。奥硝唑是继甲硝唑和替硝唑之后的第三代硝基咪唑类衍生物,具有良好的抗厌氧菌功效且副作用小^[6]。抗生素的长期应用,将产生耐药性问题,大量学者为解决这一问题,将天然药物蜂胶与大量抗生素结合制成合剂进行抑菌实验,发现蜂胶可以增强许多抗生素的抗菌效果,尤其对需氧菌或兼性厌氧菌的抑菌效果会大大增强^[7,8]。然而蜂胶能否增强抗厌氧菌作用较好的奥硝唑对Pg的生长抑制作用,国内外尚未见报道。本研究利用液体稀释法以奥硝唑为对照,观察蜂胶对牙龈卟啉单胞菌的抑菌作用。同时本实验还通过纸片扩散法了解蜂胶对奥硝唑体外抑制Pg生长的影响作用。为寻求一种理想的牙周病治疗药物提供理论依据。

实验结果显示,虽然自制蜂胶药敏片所表现出的抑菌效果不理想,但液体稀释法药敏实验发现蜂胶对Pg具有良好的生长抑制作用,最小杀菌浓度为0.156%,相当于0.125~0.25mg/L的奥硝唑。这种反差可能与蜂胶在固体载体中容易形成膜状物,影响有效成分向周围扩散有关。此外,蜂胶奥硝唑合剂药敏实验结果显示,蜂胶浓度为10%的合剂组抑菌环均大于对应浓度的单独奥硝唑组,蜂胶浓度为5%和2.5%的合剂组在奥硝唑低浓度时的抑菌环也大于对应浓度的单独奥硝唑组。这两个合剂组在高浓度时,表现出比单独奥硝唑弱的抑菌效果,可能也与蜂胶的成膜作用影响了蜂胶对奥硝唑的增强作用有关。我国学者孙丽娜等^[9]采用滤纸片法研究蜂胶对牙周病原菌的抑菌效果,发现水溶性蜂胶对实验菌没有明显的抑制效果。任凤兰等^[10]用抗生素与蜂胶制成的合剂与单一抗生素对分离出的四种病原菌做药敏试验,通过对比抑菌效果发现,实验菌对制成的合剂较敏感,而单独使用的蜂胶的抑菌效果不明显,1%浓度的蜂胶对芽孢杆菌的抑菌环仅为9.20mm,对金葡菌的抑菌环为8.68mm;并指出蜂胶具有成膜作用,蜂胶液是良好的成膜剂,用药后,蜂胶提取液浸湿了菌体,然后蜂胶提取液包围菌体的表面,干燥后即形成一层非常理想的薄膜,薄膜堵塞了菌体与外界的气体交换后窒息死亡。结合我们的实验结果,初步怀疑蜂胶的这种成膜作用可能也会影响蜂胶在固体界面的扩散,而降低其抑菌作用,具体作用效果及作用机制还有待进一步研究证实。但实验结果整体分析,蜂胶与奥硝唑存在交互作用,即蜂胶能够加强奥硝唑对牙龈卟啉单胞菌的抑制生长作用。

关于蜂胶抗菌作用的机理,一些学者进行了研究,认为蜂胶抗菌作用的有效成分主要是其所含的黄酮类化合物及多酚类^[11];也有研究说明从蜂胶中提出的单一成分(如黄酮类化合物)的抗菌作用不如总提取物,故认为蜂胶的抗菌作用可能是其所含多种成分共同作用的结果^[12]。Takaisi等^[13]报道蜂胶可通过阻止细胞分化抑制细菌的生长;此外,蜂胶还能破坏细胞膜和胞浆的有序状态,引起部分溶菌和细菌蛋白质合成的抑制。奥硝唑作为强有力的抗厌氧菌药物,它在体内主要以具有细胞毒作用的原药和具有细胞毒作用的中间产物作用于细菌的DNA,使其螺旋结构断裂或阻断其转录复制而致其死亡,达到抗菌目的^[14]。本实验将蜂胶与奥硝唑结合成合剂,其抑菌效果好于单独用药。表明二者具有抑菌协同作用,这可能与两种药物不同抗菌机理有关,但其具体作用机理还有待进一步研究。

参考文献：

1 曹采方,主编.牙周病学.北京:人民卫生出版社,2003,30,40,181.

2 周学东,肖晓蓉,主编.口腔微生物学.四川大学出版社,2002,265,386-392.

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5 张天宝,黄晓波,丘木生.蜂胶复方消毒剂杀菌效果与毒性的试验观察.中国消毒学杂志,2000,17(4):203-206.

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9 孙丽娜,宿颖,李玉晶,等.蜂胶对牙周病致病菌的抑制研究.食品科学,2007:28(7):44-47.

10 任凤兰,孙斌,徐伟.蜂胶在抗生素治疗奶牛细菌性子宫内膜炎中的作用.甘肃畜牧兽医,2003,4(171):11-13.

11 房柱.蜂胶的医疗效用.中国养蜂,1979,(3):12.

12 王晶,李玉晶.蜂胶抑制变形链球菌生长和粘附的体外研究.北京口腔医学,2002,10(4):79-81.

13 TAKAISI-KIKUNI NB.Electron microscopic and microcalomitric investigions of the possible mechanism of the anti-bacterial action of a defined propolis provenance.PLanta Med,1994,60(3):222-227.

14 Lamp KC,Freeman CD,Klutman NE,et al.Pharmacokinetics and pharmacodynamics of the nitroimidazole antimicrobial drugs.Clin Pharmacokinet,1999,36(5):353-375.