蜂胶抑制变形链球菌生长和粘附的体外研究

【摘要】目的:研究蜂胶对变形链球菌生长和粘附的影响。方法:①抑菌实验;分别将水溶性蜂胶和醇溶性蜂胶提取物等比稀释 ,采用钢管琼脂扩散法对变形链球菌和远缘链球菌做抑菌实验,测定最小抑菌浓度。②粘附抑制实验:在含不同浓度水溶性和醇溶性蜂胶,洗必泰,乙醇的轻唾液体培养基中培养变形链球菌,8天后测定粘附于毛细管表面变形链球菌量,并进行比较。结果 :对变形链球菌和远缘链球菌最小抑菌浓度分别是:水溶性蜂胶为0.031625%和0.25% ;醇溶性蜂胶均为0.078%。蜂胶各组及洗必泰组均可显著抑制变形链球菌的粘附(P<0.05),0.5%水溶性蜂胶组,醇溶性蜂胶组及洗必泰组抑制粘附作用更强,三组之间无显著性差异(P>0.05)。结论:水溶性蜂胶和醇溶性蜂胶对变形链球菌生长和粘附都有显著的抑制作用。

【作者】 王晶  李玉晶  张春梅  赵静  王凤忠

【关键词】蜂胶 变形链球菌 远缘链球菌 生长 粘附

蜂胶作为民间药物,在中外都具有悠久的应用史。近年来蜂胶对口腔病的防治作用受到人们的关注,本研究拟通过观察蜂胶对变形链球菌生长和粘附的影响,探索其可能的防龋机制,为蜂胶的开发利用提供理论依据。

材料和方法

1 蜂胶来源:20%水溶性北京蜂胶提取物;10%醇溶性北京蜂胶提取物均由中国农科院蜂蜜研究所提供。

2 细菌和培养基:

2.1 细菌:变形链球菌S.mutans Inbritt(血清型c)和远缘链球菌S.sobrinusBHR(血清型ｄ)均由我院口腔微生物研究室提供的国际参考菌株。

2.2 培养基:轻唾琼脂培养基(MSA培养基);轻唾液体培养基(MS培养基)。

2.3 菌液的制备:将s.mutans和s.sobrinus标准菌株放在MS培养基中,微需氧条件下(90%N₂ ,10 %CO₂)37℃培养48h,离心,取上清,用MS培养基调至OD=1的菌液备用。

3 实验方法

3.1 抑菌实验:用95%酒精,按倍比稀释原则,将10%蜂胶醇溶液制成8个浓度的制剂备用,最大浓度为10%;用注射用水将水溶性蜂胶按倍比稀释原则制成8个浓度的制剂备用;并以95%酒精及0.16%的洗必太作为阳性对照。在固体选择培养基中滴入0.1ml菌悬液,用三角玻棒涂平涂匀。放入34个钢管,每个钢管之间留有一定的距离,在钢管内加入上述不同浓度的蜂胶醇溶液和蜂胶水溶液,每个浓度做2个样本,所有样本放入厌氧罐中(90%N₂,10%CO₂) 37℃恒温培养48h,测定各组标本的抑菌环直径。

3.2 粘附抑制实验:将水溶性蜂胶,醇溶性蜂胶,洗必太,乙醇分别加入MS培养基,制备成0.15625%蜂胶醇溶液和0.5%、0.125%两个浓度的蜂胶水溶液,0.15625%乙醇溶液,0.16%洗必太溶液 ,另设一组空白对照组。将加入上述各试剂的MS液体培养基分装于试管中;将菌液充分混匀 ,每支试管中加入0.1ml;再将长度、直径一致,精确称重 ,消毒的毛细管置于试管中,37℃恒温温箱中,微需氧(90%N₂和10%CO₂)培养。48h后将毛细管小心移入新配制的相同试剂的MS液体培养基,继续培养48h,重复上述步骤4次。最后,取出各毛细管,烘干,称重,两次称重之差为粘附的菌斑量。各组菌斑量采用SPSS8.0统计软件,进行单因素方差分析。

结果

1 抑菌实验:蜂胶醇溶液各浓度抑菌环直径见表1。最低抑菌浓度:变形链球菌:0.078%;远缘链球菌:0.078%。蜂胶水溶液抑菌实验结果见表2,最低抑菌浓度:变形链球菌:0.031625%;远缘链球菌:0.25%。

2 粘附抑制实验:醇溶性蜂胶和水溶性蜂胶抑制粘附实验结果见表3(粘附细菌重量越少,则抗附着能力越强)。蜂胶各组及洗必泰组均可显著抑制变形链球菌的粘附(P<0.05),0.5%水溶性蜂胶组,醇溶性蜂胶组及洗必泰组抑制粘附作用更强,3组之间无显著性差异。

讨论

蜂胶是专司采胶的工蜂从枫、椴、杨或柳树等的幼芽、嫩枝和叶柄中采集来的有机物质添加了唾液分泌物而成。蜂胶有重要的生物学和药理学作用,有大量文献报告蜂胶对多种细菌有抗菌作用^[1]。本研究对口腔中主要致龋菌做了体外抑菌实验,结果表明,蜂胶对主要致龋菌(变形链球菌和远缘链球菌)有显著的抑菌作用,为蜂胶作为天然防龋剂的开发推广提供了实验依据。关于蜂胶抗菌作用的机理,一些学者进行了研究,认为蜂胶抗菌作用的有效成分主要是其所含的黄酮类化合物及多酚类^[2];也有研究说明从蜂胶中提出的单一成分(如黄酮类化合物)的抗菌作用不如总提取物 ,故认为蜂胶的抗菌作用可能是其所含多种成分共同作用的结果^[3]。关于蜂胶对细菌抗菌机理,Takaisi等^[4]报告了利用微量测热法和电子显微照相技术研究蜂胶对无乳链球菌的作用方式,结果表明,蜂胶可通过阻止细胞分化抑制细菌生长,进而导致假多细胞链球菌的形成。此外,蜂胶还能破坏细胞膜和胞浆的有序状态,引起部分溶菌和细菌蛋白质合成的抑制。由此推断,蜂胶可能是通过对变形链球菌等致龋菌繁殖和生长的影响,而表现出较强的抑菌作用。

变形链球菌对牙面有高度的粘附作用,粘附在龋病的发生中起着重要的作用。变形链球菌粘附形式可分为蔗糖依赖型和非蔗糖依赖型,由于条件的限制,我们只做了蔗糖依赖型粘附的研究。本研究蜂胶抑制粘附实验结果说明:蜂胶醇溶液和蜂胶水溶液皆有显著的抑制变链菌粘附的作用。对于蜂胶抑制粘附的机制,有文献报道^[5],是由于蜂胶抑制葡糖基转移酶的活性,抑制葡聚糖形成,从而减少菌斑所致。

蜂胶的化学成分受蜜蜂种类和植物基原、产地的差异以及气候的影响 ,即不同产地的蜂胶其所含成分的性质与数量也不尽相同^[6]。本研究所得结果虽为蜂胶作为天然防龋制剂的开发利用提供了一定的理论依据,但各地蜂胶防龋有效成分的差异及其作用机制仍需进一步深入研究。

参考文献：

1 房柱.蜂胶的研究与医药应用.连云港科技出版社.1980;44

2 林志彬.蜂胶的药理作用和临床应用.药学通报.1982;17(4):34

3 房柱.蜂胶的医疗效用.中国养蜂.1979,3:12

4 Takaisi NB ,Schilcher H .Electron microscopic and mi crocalorimetricinvestigationsofthepossiblemechanismoftheantibacterialactionofadefinedpropolis provenance.PlantaMed.1994;60(3):222

5 Koo H ,Gomes BP ,Rosalen PL .In vitro antimicrobial activi-ty of propolis and arnica montana against oral pathogens.Arch OralBiol.2000;45(2):141

6 王宗伟.蜂胶的药理作用.国外医药·植物药分册.1997;12(4):151