蜂胶对大鼠皮肤创伤愈合的影响

[摘要] 目的 探讨蜂胶对创伤愈合的影响，并初步探讨创伤愈合机制。 方法 60只健康雄性Wistar大鼠随机分为实验组（创伤模型+蜂胶组）20只、对照组（创伤模型+碘伏组）20只、空白组（创伤模型+生理盐水组）20只，每组再随机分为5个时间点（3、5、7、10、14d），每组每时间点各4只，采用手术法复制大鼠背部皮肤全层1 cm×1 cm的创伤模型，每日换药。分别于各个时间点处死大鼠，切取创面皮肤组织，计算创伤愈合率，通过HE染色观察创面组织学的变化，免疫组织化学染色法检测血管内皮生长因子（VEGF）和血小板源性生长因子（PDGF）的动态改变。 结果 与对照组比较，实验组能明显提高大鼠创伤愈合速度和愈合率（P<0.05或P<0.01）。与空白组比较，HE染色显示实验组毛细血管、胶原纤维增生明显，表皮再生完全。免疫组织化学染色显示，实验组在3 d时VEGF表达水平明显高于对照组（P<0.05），实验组在5 d时PDGF表达水平明显高于对照组（P<0.05）。 结论 蜂胶在创伤修复愈合过程中起明显促进作用，可能与其促进血管生成、促进肉芽组织以及瘢痕组织增生等作用有关。

[作者] 卞明心　沈若武　刘晓彤　李春雪　李玲　杨永华

[关键词] 蜂胶；碘伏；创伤愈合；血管内皮生长因子；血小板源性生长因子；中草药

蜂胶的药用价值极高，其化学成分包括黄酮类化合物、烯、萜类化合物及大量微量元素等300多种成分，已被证实具有降血糖、抗菌、免疫增强、抗炎，抗氧化等多种药理作用^[1-4]，其中抗菌与抗炎作用为创伤愈合提供了药理基础。近年来，国内外已有部分关于蜂胶促愈合的研究，而在临床治疗过程中，碘伏仍是外科创伤的首选消毒、促愈合药物。本文将蜂胶作为促愈合剂用于创伤模型，通过HE染色观察皮肤组织愈合过程，免疫组织化学染色动态观察血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、血小板源性生长因子（platelet-derived growth factor，PDGF）的表达水平^[5]，与碘伏进行对比，观察蜂胶对创伤愈合的影响并初步探究其机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组

成年健康的Wistar大鼠60只，雄性，15周，体质量（280±10）g，购自青岛市药品检验所实验动物中心，动物合格证号：SCXK（鲁）20100010。单笼单只饲养于28℃清洁级动物实验室内。随机分成实验组、对照组和空白组，每组20只。

1.2 创伤模型的建立与干预方法

采用手术法切除大鼠背部皮肤进行造模[6]。造模当天以10%的水合氯醛（0.3ml/100g）腹腔注射麻醉，用剃毛器及脱毛剂于大鼠背部胸段两侧脱毛，暴露皮肤面积约24 cm2。用手术刀于胸段两侧作1cm×1 cm切口，切除全层皮肤至深筋膜，形成两个正方形创面。用无菌棉球擦拭止血，实验组涂抹蜂胶（成都宝芝堂生物科技有限公司，G20100714），对照组涂抹碘伏，空白组涂抹生理盐水，拍照记录。用无菌纱布包扎，绷带固定。大鼠每日自由进食、饮水。每日换药，换药前记录创口面积。

1.3 组织取材及处理

分别于手术后3、5、7、10、14 d灌流固定实验动物，每组4只，固定前记录创口面积，不换药。切取以创面为中心的2 cm×2 cm组织块，每只取2块，常规脱水，透明，石蜡包埋，切片，每块组织切3张切片，每组24张，随机分为4个亚组，分别进行常规HE染色，VEGF、PDGF检测采用SABC免疫组织化学染色，并严格按照试剂盒说明进行操作，光镜下观察组织变化。

1.4 免疫组织化学染色结果判断

每个亚组选取6张切片，400倍镜下随机选取5个视野，应用Simple-PCI图像分析系统对组织照片进行定量分析。VEGF的表达以阳性细胞表达百分比表示（阳性细胞百分比=阳性细胞数/视野总细胞数×100%）。阳性细胞主要为胞质着色，表达为棕黄色或棕褐色颗粒。判断标准如下：染色面积<10%（-），染色面积≥10%（+）。PDGF的表达以平均光密度值表示，阳性细胞主要为胞质着色。

1.5 统计学处理

应用SPSS 20.0统计学软件进行数据处理，计量资料以x±s表示，正态分布检验采用单样本Kolmogorov-Smirnov检验，检验符合正态分布后采用单因素方差分析对各组均数进行比较，各组均数间两两比较采用SNK检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 3组不同时间创面愈合率的比较

3d时，各组间愈合率差异有统计学意义（F=10.56，P<0.01），通过SNK检验，实验组愈合率明显高于对照组（q=3.57，P<0.01），同时明显高于空白组（q=4.28，P<0.01）；5d时，各组间愈合率差异有统计学意义（F=4.22，P<0.05），实验组愈合率明显高于空白组（q=2.75，P<0.05），对照组愈合率明显高于空白组（q=2.17，P<0.05）；7d时，各组间愈合率差异有统计学意义（F=4.58，P<0.05），实验组愈合率明显高于空白组（q=2.77，P<0.05），对照组愈合率明显高于空白组（q=2.44，P<0.05）；10d时，各组间愈合率差异无统计学意义（F=0.36，P>0.05）；14 d时，各组间愈合率差异有统计学意义（F=127.06，P<0.01），实验组愈合率明显高于对照组（q=5.66，P<0.05），同时明显高于空白组（q=15.74，P<0.01），对照组明显高于空白组（q=10.07，P<0.01）（表1）。

2.2 HE染色结果

3d时，实验组与对照组仍有单核粒细胞渗出，伴有少量毛细血管增生，空白组中性粒细胞渗出明显，炎细胞浸润程度较高。5d时，实验组出现较多毛细血管增生，肉芽组织生长旺盛，成纤维细胞增生，伤口进入典型增殖期。对照组成纤维细胞数量较少，肉芽组织生长情况较弱。7d时，实验组肉芽组织进一步生长，生发层开始增厚，毛细血管数量增多，表皮细胞开始从伤口边缘向中心移行。对照组未见表皮细胞的增殖移行。10d时，各组均有肉芽组织填埋伤口，纤维组织增生明显，瘢痕组织开始形成，实验组新生上皮较厚，移行较快。14d时，实验组创面已被填埋，上皮完整，愈合基本完成；对照组与空白组上皮较薄，再生不完全（图1）。

2.3 3组不同时间VEGF、PDGF表达水平的比较

VEGF表达水平在3d时，各组间表达差异有统计学意义（F=4.20，P<0.05），通过SNK检验，实验组VEGF表达水平明显高于对照组（q=2.66，P<0.05），同时明显高于空白组（q=2.32，P<0.05）；5d时，各组间表达差异有统计学意义（F=3.94，P<0.05），实验组VEGF表达水平明显高于对照组（q=2.81，P<0.05）；7d时，各组间表达差异有统计学意义（F=4.22，P<0.05），实验组VEGF表达水平明显高于对照组（q=2.56，P<0.05），空白组VEGF表达水平明显高于对照组（q=2.47，P<0.05）。PDGF表达水平在5 d时，各组间表达差异有统计学意义（F=6.48，P<0.05），通过SNK检验，实验组PDGF表达水平明显高于对照组（q=3.56，P<0.01）；7d时，各组间表达差异有统计学意义（F=7.685，P<0.01），实验组PDGF表达水平明显高于对照组（q=3.84，P<0.01），空白组PDGF表达水平明显高于对照组（q=2.59，P<0.05）；10 d时，各组间表达差异有统计学意义（F=6.47，P<0.05），对照组PDGF表达水平明显高于实验组（q=3.57，P<0.01）；14d时，各组间表达差异有统计学意义（F=8.61，P<0.01），实验组PDGF表达水平明显低于对照组（q=3.78，P<0.01），同时明显低于空白组（q=3.37，P<0.01）（表2、图2）。

3 讨论

蜂胶广泛的药理作用使其即可内服又可外用，并且具有外用创伤药的普遍作用效果^[7-8]，在2010年版的《中华人民共和国药典》（简称《中国药典》）中就记载了蜂胶“外用解毒消肿，收敛生肌”的功效[9]，促愈合效果显著。

本实验结果显示，对照组、实验组的创伤愈合率均明显高于空白组（P<0.05），说明蜂胶具有明显促进伤口愈合的效果。3d时，实验组创伤愈合率明显高于对照组（P<0.05），说明蜂胶与碘伏相比，能够有效促进创面的收缩，减少创面面积及表皮爬行范围，加快愈合。从常规HE染色结果得出，实验组肉芽组织从3d开始出现明显增殖现象，肉芽毛细血管丰富，生长旺盛，加快愈合，说明蜂胶能加快肉芽组织的形成，在一定程度上促进成纤维细胞的增殖，使创伤修复加快进入增殖期。

VEGF是特异性最高同时也是作用最强的血管生长因子，其可促进血管内皮祖细胞增殖，增加血管的通透性，促进血管的生成，同时与肿瘤的发生、发展具有一定的相关性^[10-12]。琚晨焰等[13]发现，胃癌组织中VEGF阳性表达率明显较高，与胃癌的发展、侵袭和转移有密切关系。通过动物实验，陈芳等^[14]发现，VEGF高水平表达极大地促进了肿瘤血管的生长，对血管内皮细胞的损伤具有拮抗作用。创伤组织中丰富的新生血管为创面提供了充足的氧气和营养物质，保证了肉芽组织迅速增生。本研究免疫组织化学染色中，VEGF在创伤愈合早期起显著作用，实验组3d时表达水平与对照组、空白组比较差异均有统计学意义（P<0.05），说明实验组能有效刺激VEGF的生成，促进伤口组织毛细血管的增生、增殖，为创面愈合提供必需的物质条件。
PDGF能使成纤维细胞和血管内皮细胞直接参与肉芽组织的形成，促进炎症细胞的浸润，促进细胞产物增多，使胶原合成增多，还可以促使VEGF转录和分泌从而促进血管生成^[15-18]。Hom等^[19]通过病例研究发现，使用PDGF治疗可以促使患者伤口内肉芽组织得到充分填埋； LaRochelle等^[20]发现，PDGF与卵巢、肾、肺等部位的癌症患者均有一定的相关性，可促进肿瘤的侵袭。创面组织中PDGF的含量高低可以很好地反映创面增殖期伤口的愈合情况。本研究免疫组织化学染色中，PDGF在5 d时呈高表达，5、7 d时表达水平与对照组比较差异有统计学意义（P<0.05），说明实验组能够更早形成大量的肉芽组织，激发肉芽组织的增殖生长，加快创面充填，加速愈合。

综上所述，蜂胶在创伤修复方面疗效可观，与单纯擦拭碘伏相比具有更好的促愈合效果，值得在临床创伤修复治疗中推广应用。

[参考文献]

[1] 罗照明，张红城.中国蜂胶化学成分及其生物活性的研究[J].中国蜂业，2012，63（2）：55-62.

[2] 于倩，林静，祖力卡尔江・阿合买提，等.伊犁黑蜂蜂胶对口腔主要致龋细菌生物膜作用的实验研究[J].华西口腔医学杂志，2015，33（4）：343-346.

[3] 高蓬勃，徐响，高丽苗，等.蜂胶化学成分与地理源、植物源的研究进展[J].食品安全质量检测学报，2015，6（8）：3172-3176.

[4] 王启海，黄文斌，韩军，等.蜂胶总黄酮对全脑缺血-再灌注损伤大鼠脑组织病理学及细胞凋亡的影响[J].中药材，2015，30（6）：1488-1492.

[5] 顾永峰.皮肤创伤愈合过程的研究[J].亚太传统医药，2010，6（7）：165-166.

[6] 付万进，王晖，庞玉新，等.皮肤创伤模型研究进展[J].广东药学院学报，2013，29（2）：214-218.

[7] 张晓义，唐祝奇，刘春，等.鲜蟾皮外敷促进糖尿病大鼠皮肤溃疡愈合的实验研究[J].交通医学，2013，27（5）：435-438.

[8] 张溪，廖成静，贾赤宇.芦荟在烧伤创面应用的研究进展[J].中华损伤与修复杂志（电子版），2015，10（1）：80-82.

[9] 国家药典委员会.中华人民共和国药典[M].北京：中国医药科技出版社，2010：337.

[10] 王佳琪，王国栋，颜红柱，等.生长因子在创伤愈合中作用的研究[J].创伤外科杂志，2013，15（3）：281-283，289.

[11] 宁尼亚，刘松凡.VEGF与卵巢癌的研究进展[J].中国当代医药，2014，21（22）：186-188.

[12] 薛栋，赵海霞，常刚，等.人胰腺癌中Livin及血管内皮生长因子的表达及其临床意义[J].国际肿瘤学杂志，2014， 41（9）：700-703.

[13] 琚晨焰，胡小云，张文昌，等.胃癌组织中Galectin-3和VEGF的表达及其临床意义[J].南昌大学学报（医学版），2010，50（3）：25-28，139.

[14] 陈芳，薛远，曹义海，等.肿瘤相关性恶液质：VEGF作用机制的实验研究[J].中国肺癌杂志，2009，12（4）：283-288.

[15] 屈纪富，郝利，孙薇，等.细胞因子在创伤愈合过程中的变化及其意义的研究进展[J].创伤外科杂志，2003，5（1）：74-76.

[16] Gassmann MG，Stanzel A，Werner S.Growth factor-regulated expression of enzymes involved in nucleotide biosynthesis：a novel mechanism of growth factor action[J].Oncogene，1999，18（48）：6667-6676.

[17] Wang XR，Wang CD，Liu XM，et al.Effect of PDGF-Rb antagonist imatinib on endometrial injury repairing in mouse model[J].Asian Pac J Trop Med，2015，8（7）：555-559.

[18] Wu CF，Chiang WC，Lai CF，et al.Transforming growth factor β1 stimulates profibrotic epithelial signaling to activate pericyte-myofibroblast transition in obstructive kidney fibrosis[J].Am J Pathol，2013，182（1）：118-131.

[19] Hom DB，Manivel JC.Promoting healing with recombinant human platelet-derived growth factor―BB in a previously irradiated problem wound[J].Laryngoscope，2003，113（9）：1566-1571.

[20] LaRochelle WJ，Jeffers M，Corvalan JR，et al.Platelet-derived growth factor D： tumorigenicity in mice and dysregulated expression in human cancer[J].Cancer Res，2002， 62（9）：2468-2473.