蜂胶对炭疽杆菌的抑菌活性

【摘要】目的 了解产自河南省的蜂胶对炭疽杆菌的抑菌作用。方法 采用琼脂平板扩散法,将实验分为pH5.5～8.5不同组(蜂胶浓度31%),以及在pH5.5下设置10个不同浓度组,即将31%蜂胶溶液倍比稀释至0.06%(1∶512)及空白组(0),每组3次重复,每张滤纸片(?6mm)滴加蜂胶溶液7μl,记录蜂胶的抑菌效果。结果 河南省蜂胶在pH5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5平板上的抑菌环直径依次为(19.16±0.29)、(17.67±0.29)、(14.67±0.58)、(13.67±0.29)、(14.00±0.00)、(13.33±1.15)、(12.00±0.00)mm,蜂胶浓度分别为15.50%、7.75%、3.88%、1.94%、0.97%、0.48%、0.24%、0.12%、0.06%和0(空白组)时,抑菌环直径依次为(19.50±1.80)、(19.67±1.04)、(17.75±0.35)、(15.67±0.58)、(14.00±2.29)、(13.17±1.04)、(11.83±1.53)、(10.83±1.26)、(9.00±0.00)和(0.00±0.00)mm。结论 河南省蜂胶对炭疽杆菌有明显的抑菌活性,对炭疽杆菌的抑菌活性随pH值增加或浓度降低而减小。

【作者】 许兵红  曾莉萍

【关键词】蜂胶 炭疽杆菌 抑菌活性

蜂胶(propolis)是蜜蜂从植物芽孢或树干上采集的树胶混入蜜蜂上颚腺分泌物和蜂蜡后加工制成的树脂状固态物质,含有大量的生物活性物质和微量元素,具有广泛的药理作用。Kujumgiev等^[1]研究报道,不同产地的蜂胶虽然在化学组成上有所不同,但抗菌作用基本相同,显示蜂胶抗菌活性为混合物整体效果。Hegazi等^[2]对产自奥地利、德国和法国三地的蜂胶对比研究发现,三地蜂胶化学组成中各成分比例不同,抗菌活性也不尽相同。近几年,蜂胶文献日渐增多。我国对蜂胶抗菌作用的公开报道较少,尚无系统性研究报道,关于河南省蜂胶的抗菌活性,乔智胜和陈瑞华^[3]曾报道从蜂胶中分离到3种对金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)具有抗菌活性的成分,以后再无相关公开报道。我们课题组首次就河南省蜂胶对医学原虫的抗菌作用^[4,5]、对常见医学真菌的抗菌作用^[6]和对常见医学细菌的抗菌作用^[7-10]进行系统研究,现将河南省蜂胶对炭疽杆菌的抑菌作用结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 蜂胶溶液配制将产自河南省的蜂胶溶于95%乙醇,2周后过滤,得蜂胶乙醇溶液,计算其浓度为31%。

1.1.2 应试菌种炭疽杆菌(Bacillus anthracis)弱毒株购自北京生物制品研究所,由本实验室传代保种,使用前接种到pH6.5固体培养基上,37℃恒温培养16~18h备用。

1.2方法

1.2.1 抑菌活力测定

采用平板滤纸片法,滤纸片Φ6.0mm,灭菌干燥后备用。固体培养基采用肉汤培养基:牛肉500g(浸液)、蛋白胨10g、NaCl5g、K₂HPO₄·12H₂O 1g、琼脂20g,加双蒸水至1000ml,调pH至6.5,每个Φ7.5cm培养皿加入12ml培养基,制成平板备用。细菌复苏培养后,取培养至对数期细菌配成6×10⁸cells/ml菌液,取0.1ml涂于平板上,将滤纸片加7μl蜂胶溶液样品,37℃培养24h后测量记录抑菌环直径。

1.2.2 不同pH值实验

设置5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5共8个不同的pH值平板实验组,每组3次重复,记录31%河南省蜂胶在不同pH值平板上的抑菌效果。

1.2.3 不同浓度实验

培养基pH5.5时,设置不同浓度蜂胶实验组和空白对照组,蜂胶原液(31%)按1∶2倍比稀释至1∶512,95%乙醇(蜂胶浓度0)作对照组,即设置1个空白对照组和9个蜂胶浓度组:蜂胶原液1∶2稀释组即浓度为15.5%,剂量为1085μg;蜂胶原液1∶4稀释组即浓度为7.75%,剂量为542.5μg;依次类推至蜂胶原液1∶512稀释组即浓度为0.06%,剂量为4.23μg。每组3次重复,记录各组的抑菌效果。

1.2.4 统计学方法

所得数据计算x±s,采用t检验对结果进行统计学分析。

2 结果

2.1 不同pH值蜂胶对炭疽杆菌的抑菌效果

pH5.0时,不适宜炭疽杆菌生长,未观察到抑菌现象。其余各组均有抑菌现象,pH5.5时河南省蜂胶对炭疽杆菌抑菌环直径最大,随pH值增加,抑菌环直径变小(表1)。

2.2 不同浓度蜂胶对炭疽杆菌的抑菌效果

随浓度降低,河南省蜂胶对炭疽杆菌的抑菌环直径变小,蜂胶原液稀释至1∶512即0.06%时,仍有抑菌环,但环小。空白对照组未观察到明显的抑菌环(表2)。

3 讨论

蜂胶在世界上有着悠久的药用历史,其成分复杂,大约由55%树脂及树香、30%蜂蜡、10%芳香挥发油、5%花粉及杂物组成。目前已从蜂胶中分离鉴定的成分有黄酮类、萜烯类、醌类、酯类、醛类、酚类、醚类、有机酸等,还有氨基酸、酶类、维生素类及多糖等物质。蜂胶的化学成分取决于蜜蜂采集树脂的植物和地区,因而不同产地的蜂胶化学组成不同,生物学活性也有差异。温带型蜂胶以欧洲蜂胶为代表,主要成分为黄酮类,如白杨素(chrysin)、高良姜素(galangine)、松属素(pinocembrin)、槲皮素(quercetin)、柚皮素(naringenin)、咖啡酸(caffeic acid)、阿魏酸(ferulaicacid)等。热带型蜂胶以巴西蜂胶为代表,主要成分为烯萜类、芳香酸及其酯类、脂肪酸等^[11]。蜂胶中独特的黄酮类、萜烯类物质,对多种细菌^[12-15]、真菌^[16，17]、病毒^[18]和寄生虫^[19-21]等有抑制和杀灭作用,研究报道主要为国外文献。对炭疽杆菌的抑菌活性国内外尚未见相关公开报道,但对同属的蜡样芽孢杆菌(Bacilluscereus)和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)报道均有抑菌活^[12,22,23]。

本次实验表明,pH5.5时河南省蜂胶对炭疽杆菌抑菌环最大,随pH值增加,抑菌环变小。随浓度降低,河南省蜂胶对炭疽杆菌的抑菌环变小,蜂胶原液稀释至1：512即0.06%时,仍有抑菌环产生。pH5.5和6.0组抑菌环显著大于其余各pH组(t_5.5:6.5=11.99,t_5.5:7.0=23.18,t_5.5:7.5=30.82,t_5.5:8.0=8.51,t_5.5:8.5=42.77,t_6.0:6.5=8.01,t_6.0:7.0=16.89,t_6.0:7.5=21.92,t_6.0:8.0=6.34,t_6.0:8.5=33.87,P<0.01)。pH8.5时河南省蜂胶对炭疽杆菌抑菌环最小,与pH5.0～7.5各组差异有统计学意义(t6.5∶8.5=7.97,t7.0∶8.5=9.98,P<0.01)。pH6.5～8.0各组间差异无统计学意义(P>0.05)。结果提示,河南省蜂胶对炭疽杆菌有明显的抑菌活性,在酸性条件下对炭疽杆菌的抑菌活性较强。这种随pH值增高而抑菌活性减弱的变化规律,与课题组前期报道的河南省蜂胶对其他革兰阳性菌如:溶壁微球菌(Micrococcus lysodeikticus)^[7]、金黄色葡萄球菌^[8]、甲型链球菌(Streptococcus viridans)、乙型链球菌(Streptococcus hemolyticus)^[9]、白喉杆菌(Corynebacteriumdiphtheriae)^[10]的结果相一致;而与对真菌白色念珠菌(Candida albicans)^[6]的抑菌作用相反。进一步的研究尚在进行中。

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