蜂王浆蛋白多肽及其生物活性研究进展

摘 要：蜂王浆（RJ）是6 d~18 d龄青年工蜂发达的下咽头腺和上颚腺等腺体所分泌的特殊浆状物质。蜂王浆中的干物 质以蛋白质含量最多，蜂王浆中的主要王浆蛋白（MRJPs）具有广泛的生物学活性。通过直接分离或者先用蛋白酶水解再分离蜂王浆中的活性蛋白质和肽类，发现了其具有抗氧化、抗菌、免疫调节、降血糖、促进细胞增殖、抗肿瘤、抗疲劳、降血压、保护神经细胞等众多功能。随着现代分离分析技术及基因组学、蛋白质组学的发展和蜜蜂基因组测序的 完成，蜂王浆蛋白复杂的物质基础和作用机制都将逐一呈现，并且能够广泛应用于生物医药、科研、食品、化妆品等领域。

关键词：蜂王浆；蛋白质；肽类；功能

作者：孙平1，2 ，颜慧1，张可朋3 ，宋耕福3 ，冯成强1（1. 中药资源保护与利用北京市重点实验室，北京 100875；2. 北京师范大学资源学院 资源生态与中药资源研究所，北京 100875；3. 北京京卫燕康药物研究所有限公司，北京 100070）

蜂王浆（Royal Jelly）又名蜂皇浆，简称王浆，俗称 蜂王乳，是6 d~18 d龄青年工蜂发达的下咽头腺和上颚腺等腺体所分泌的特殊物质。蜂王浆呈乳白色或淡黄色，半透明，微黏稠，有特殊香味，味酸、涩辛、微甜，主要为蜂王的终身食物及工蜂幼虫前3天之用[1]。蜂王与 工蜂由同一受精卵发育而来，而终身食用王浆的蜂王， 其寿命比工蜂长10倍以上，且蜂王每日能产下2 000粒卵，其重量几乎与蜂王体重相近。由此可见，蜂王浆具 有非常神奇的功效。

蜂王浆是目前为止所发现的世上最原始的、最好 的天然滋补品之一，医疗保健效果极佳且无副作用，是 世界上公认的能使人长寿的食物。蜂王浆具有免疫调 节、抗菌、抗炎、抗肿瘤、调节血压、降低血糖和促进细 胞生长等功能[2-9]。另外，蜂王浆有益寿延年、降脂降糖、 改善睡眠、提高记忆力、护肤养颜等作用，也是患有糖尿病、心脑血管疾病、肿瘤等病的人群或体弱多病的中老年人首选的珍贵天然食物[10]。 蜂王浆具有如此神奇且广泛的生理活性，这与蜂王浆中众多的生物活性物质是密不可分的，其中占蜂 王浆干重30 %~50 %的蛋白及肽类起着非常关键的作用，近年来对它们的研究已成为热点。众多学者已经从基因组学、分子生物学、药理学等方面对蜂王浆蛋白质及肽类的结构和功能作出了科学的阐述，因此，本文主要介绍蜂王浆蛋白质和肽类成分以及相关的生物学 功能。

1 蜂王浆中的蛋白类物质

现代研究表明，鲜蜂王浆的成分相当复杂，含有 水分60 %~70 %，蛋白质12 %~15 %，脂类3 %~6 %，糖 类10 %~16 %，维生素、游离氨基酸、矿物质等2 %~ 3 %。其中蛋白质、糖类等主要成分随着蜜蜂的品种、蜜源种类、生产季节、气候条件、蜂群生长状态、哺育蜂的年龄等因素的变化而变化。蜂王浆中的干物质以蛋白质含量最多，约占30 %~50 %，其中还含有大量活性蛋白酶，如胆碱脂酶，葡萄糖氧化酶，淀粉酶，脂肪酶， 转氨酶和超氧化物歧化酶（SOD）等，这些酶都对人体 有着极其重要的生理功能[11-15]。蜂王浆蛋白由水溶性蛋白和非水溶性蛋白组成，水溶性蛋白占总蛋白含量的46 %~89 %，为王浆蛋白的主要部分，称为主要王浆蛋白（major royal jelly proteins，MRJPs）[16]。MRJPs家族至今已经鉴定出9个成员：MRJPs 1-9[17-19]，其中5种蛋白质，即MRJP1-MRJP5，占蜂王浆总蛋白的82 %~90 %，而MRJP1占水溶性蛋白总量的48 %[20]。MRJP1是一个弱酸性糖蛋白，并且能形成350 ku~420 ku的寡聚体[21-23]，MRJP2、MRJP3、MRJP4和MRJP5分别为49 ku，60 ku ~70 ku，60 ku和80 ku的糖蛋白[24]。随着现代分子生物学的发展，意大利蜜蜂（Apis mellifera L.）MRJPs的基因序列已经全部测定，并发现它们来源于一个黄蛋白基因家族，MRJP1-9的编码区序列（cds，coding sequence）碱基数目分别为：1229、1359、1 635、1395、1797、1 314、1332、1251、1272 bp。

2 蜂王浆中天然蛋白质生物学功能

蛋白质是维持生物体生长代谢的基础物质，蛋白质和肽类很可能是蜂王浆神奇作用的关键物质。由于蜂王浆中的蛋白质在干物质中占有较大的比重，蜂王浆中的MRJPs被认为是从幼虫到蜂王的发育过程及蜂王发挥特殊生理功能的关键因素，另外，蜂王浆在体外也具有广泛的生物学活性[20-21]。世界各国科学家通过直接的方法从蜂王浆中分离获得一系列的蛋白质和肽类，并阐述了相关的生物学功能。

2.1抗氧化作用

现代研究表明，生物体内会生成如超氧阴离子自由基、羟自由基等活性氧（ROS），但也存在着抗氧化保护系统，蜂王浆中便含有人体所需的超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-PX），这与蜂王浆抗氧化、抗衰老是密不可分的。

2.2抗菌作用

关于蜂王浆中活性蛋白类和相关的药理活性，已经有人做了大量的研究。Suguru Fujiwara 等发现并鉴定了一个新的抗菌肽royalisin ，发现它能够抗革兰氏阳性菌，但不能抗革兰氏阴性菌[25]。Fontana等从蜂王浆中分离了4种抗菌肽，这些抗菌肽属于同一个蛋白质家族 Jelleines， 并 分 别 命 名 为 Jelleine -I、Jelleine -II、Jelleine-III、Jelleine-IV。研究人员通过氨基酸测序，体外合成、纯化，进行了一系列的生物学实验。他们通过测定抗菌肽的抗菌活性、肥大细胞脱颗粒活性和溶血试验，发现Jelleine-I、II、III对酵母、革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌有特异性抗菌作用，而Jelleine-IV在进行的实验中没有表现出活性[27]。

2.3免疫调节作用

Lidija等发现王浆通过刺激抗体产生和免疫活性细胞增殖而起到免疫调节的作用，但不知是何种组分在发挥作用[26]。Okamoto等的研究揭示了MRJP3的抗过敏作用。他们通过卵清蛋白／明矾免疫小鼠，经anti-CD3刺激衍生的脾细胞，抑制IL-4的产生，从王浆中筛选抗过敏因子，采用一系列柱色谱分析，分离纯化了一个70 ku的糖蛋白，即MRJP3。体外试验表明，MRJP3不仅能抑制IL-4的产生，还能通过抑制T细胞增殖而抑制IL-2和IFN-γ的产生[28]。更有意思的是，MRJP3作为外源蛋白，本身具有抗原性，经腹膜注射却能抑制免疫小鼠血清anti-OVA IgE和IgG1的水平。另外，经过热处理的MRJP3，抗原性得到了降低，但也能显示出抑制抗体应答的作用[29]。Albert 等证明MRJP3是具有多态性的一组蛋白质，这是由重复串联序列决定的[30]。

2.4促进细胞增殖的作用

Kamakura等研究了王浆57 ku蛋白（MRJP1）的生理学作用，他们通过对大鼠原代肝实质细胞的培养，发现57 ku蛋白能显著地促进肝细胞的DNA合成，而常用的牛血清却无此作用，因此，57 ku蛋白可以起到保护肝脏的作用。另外，它还能增加白蛋白的合成，促进细胞增殖，提示57 ku蛋白可能起到细胞分裂素的作用[31]。但长时间和高温下储存后，活性便降低了，这至少与MRJP1的降解有关。随后，57 ku蛋白的作用机理被阐明[32]。2002年，K. Bilikova.纯化并鉴定了一个新的富含 丝氨酸和缬氨酸的肽，被命名为Apisimin，它包含54个氨基酸[22]，Kimura等在随后的实验中证明350 ku糖蛋白Apisin能刺激人体单核细胞的增殖[23]。Salazar-Olivo等从蜂王浆中获得的蛋白质RJP30和RJP60能够刺激Tn-5B-4细胞的贴壁生长；RJP30能促进3T3-F442A前脂肪细胞的增殖，增殖效率是小牛血清的2倍；获得的粗蛋白RJCP能够显著提高Tn-5B-4细胞的增殖，增殖效率是小牛血清的2倍多[7]。

2.5降血糖的作用

经放射性免疫分析和体外细胞实验证明，蜂王浆降血糖的机理是因为其中含有几种类似胰岛素样的多肽，调节胰岛素的作用，因此，它们可能是使血糖降低的有效成分[7]。另外，蜂王浆蛋白具有修复受损细胞、促使受损组织再生的功能，能使胰腺细胞代谢恢复正常， 促进胰岛素的分泌，而发挥正常的糖代谢作用。

2.6 抗肿瘤作用

Salazar-Olivo等研究发现，在HeLa癌细胞中加入从蜂王浆中提取出的蛋白RJP30培养7 d后，细胞数目比起始细胞数减少了2.5倍，提示RJP30对人类HeLa癌细胞具有细胞毒性作用[7]。Bincoletto等也发现王浆能阻止因肿瘤细胞增殖而导致的骨髓抑制[4]。Majtan等运用基因工程的方法，在体外表达了重组的Apal（MRJP1）并进行了功能检验，发现其能刺激巨噬细胞释放肿瘤细胞坏死因子（TNF-a）[33]。

2.7 抗疲劳作用

Kamakumra等报道的抗疲劳作用可能与MRJP1有关[34]。具有相同游泳能力的小鼠随机分为3组，分别给予新鲜收集并贮存于-20 ℃的RJ（I组），40 ℃下放置7 d的RJ（II组），以及酪蛋白、玉米淀粉和色拉油混合的对照溶液（Ⅲ组），与Ⅲ组相比，I组游泳耐力显著提高，血清乳酸盐和血氨蓄积显著降低，肌糖原消耗减少，II组和III组的这些参数之间无显著差异。另外，还有许多的研究揭示了王浆中其他成分的作用。

3酶水解后的蜂王浆蛋白类生物学功能

从蜂王浆中提取分离出的有效成分大部分为分子量较大的蛋白成分，而大分子的蛋白在体内的作用机制存在一定的模糊性，主要原因是它们进入肠道后会分解为小分子物质。因此，一些科学家尝试先通过蛋白酶水解蜂王浆蛋白，然后再分析其相关功能。于是，一些新的蜂王浆肽类物质及其生物学功能被发现。

3.1 降血压作用

Matsui等报道，蜂王浆经胃蛋白酶、胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶水解后，其产物具有抑制血管紧缩素的作用，并能降低先天性高血压大鼠的收缩压，从而起到降血压的作用，这些降血压成分来源于MRJP1，虽然MRJP1本身没有降血压的作用，但是通过酶水解之后可以产生降血压的肽类。利用此方法，他们还首次鉴定出了8个降血压肽[35]。Tokumaga等的研究也证明了此内容[36]。

3.2 抗氧化作用

Takeshi Nagai等用胃蛋白酶，胰蛋白酶和木瓜蛋白酶处理蜂王浆后，通过对比酶解液与蜂王浆的水溶性和碱溶性提取物抗氧化活性，发现经过每一种酶水解之后，抑制亚油酸的过氧化能力、清除超氧阴离子自由基和羟自由基的能力有显著的提高[37-39]。Hang Guo，Ai Ekusa等发现有蛋白酶P处理的蜂王浆具有体内与体外的脂质过氧化抑制作用，而且其抑制作用比水溶性提取物更强[40]。最近，Hang Guo，Yoshiaki Kouzuma等人利用蛋白酶N酶解蜂王浆蛋白，通过测定酶解液抑制亚油酸的氧化能力、羟自由基、超氧阴离子自由基和过氧化氢的清除能力，从酶解液中分离和纯化了来源于MRJP1-8的29个抗氧化肽段，明确了它们的结构和性质，并发现它们清除羟自由基、过氧化氢、超氧阴离子基团的活性非常显著[41]，先前，他们也用相似的方法鉴定出了14个抗氧化肽。蜂王浆中蛋白质和肽类显著的抗氧化作用有可能是蜂王浆延缓衰老的关键物质。

3.3保护神经细胞的作用

松冈拓磨，渡边铃代等以从蜂王幼虫中提取的蛋白酶类水解蜂王浆，得到了小分子的多肽，具有降低神经细胞非特异性的细胞变性作用；对神经胶质细胞具有细胞增殖作用[42]。由此可见，蜂王浆中的肽类物质可能是蜂王浆的抗老年痴呆病、抗神经退行性疾病重要的成分。

3.4 抗肿瘤作用

Majtan等证明Apal（MRJP1）能刺激巨噬细胞释放肿瘤细胞坏死因子（TNF-a），更重要的发现是，重组Apal经胰蛋白酶部分消化后，其免疫刺激功能显著增强，并且已被证明Apal的重组片段的N末端与其他3个对照片段相比有最高的刺激活性[33]。值得注意的是，蜂王浆蛋白酶解之后，活性强的肽段大多集中在10个氨基酸以下，这可能与进入细胞的难易程度有关，分子量越小的肽段，越容易进入到细胞内部，发挥药理活性。

4蜂王浆中蛋白质和肽类研究展望

可以发现，当今科学家大量的研究的都集中在蜂王浆中天然存在的一些功能分子上，而蜂王浆在体内发挥作用不可避免的会经过酶的消化，这包括唾液酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶等。天然的蛋白功能因子在消化吸收后可能不再具有特殊的生理功能。

因此，可以把酶消化后的蜂王浆作为研究对象，再研究其中的功能因子，会到的更加理想的有效成分，其相关的作用机制也会更加容易研究。上述研究表明，蜂王浆的酶水解液中含有某些更理想的功能因子，而且更利于体内的代谢吸收。另外，蜂王浆一般需要低温冷冻保藏，因为蜂王浆中所含的王浆蛋白和蛋白酶类对温度十分敏感，高温贮存过程中部分蛋白质和糖类会发生美拉德反应（Maillard reaction）而变性，水溶性蛋白质的降解产物发生聚合导致水不溶性蛋白质的增加，而水溶性蛋白质在蜂王浆的保健功效中起着举足轻重的作用[43]。而酶水解后的蜂王浆存储条件不再那么严格， 蜂王浆的酶水解物可能会成为其更方便的存储形式。

因此，利用不同的细胞模型、动物模型及临床实验，分离蜂王浆酶水解液中的活性蛋白质和肽类，通过分子生物学，将这些功能性肽类物质从王浆蛋白序列中定位、分析，再通过基因工程的方法大量合成这些功能肽类，不仅阐明蜂王浆的生物学功能，而且能为蜂王浆蛋白多肽药物的研发提供理论依据。从而使其广泛应用于生物医药、科研、食品、化妆品等领域，更好的促进科学技术和人类社会的发展。

参考文献：（略）