蜂胶黄酮清除自由基作用的研究

摘要：采用乙醇回流提取法提取蜂胶黄酮。并用乙酸乙酯对乙醇提取物进行精制。通过邻苯三酚自氧化法，邻二氮菲一Fe²⁺法和DPPH法评价其清除自由基的能力。并比较了蜂胶黄酮与VC、银杏黄酮等自由基清除剂的作用效果。研究结果表明：蜂胶黄酮有较强的自由基清除能力。

关键词：蜂胶：黄酮：自由基；清除

作者：徐颖，方金凤，顾岚 陕西科技大学生命科学与工程学院(西安710021)

蜂胶被誉为“紫色黄金”，是蜜蜂用从植物嫩芽及树干上采集的树脂并混入自身上颚腺分泌物和蜂蜻混合而成的一种具有芳香气味的胶状固体物。蜂胶具有较强的抑菌作用，能治疗多种疾病，并具有天然的抗氧化性能和增强机体的免疫功能。蜂胶的生物学、药理学及医疗功效主要与蜂胶中所含的黄酮成分有关。蜂胶含40余种黄酮化合物，其黄酮成分与产地及采集季节不同而有明显差异^[1]。

自由基是人体正常的代谢产物，正常情况下人体内自由基是处于不断产生与清除的动态平衡中。人体内存在少量的自由基不但对人体不构成威胁，而且可以促进细胞增殖，刺激白细胞和吞噬细胞杀灭细菌，消除炎症，分解毒物^[1]。但机体内过量的自由基能攻击细胞组织中的脂质、蛋白质、糖类和DNA等物质，造成脂质和糖类氧化、蛋白质变性、酶的失活、DNA结构的切断或碱基变化等改变，从而导致细胞膜、遗传因子等损伤，因而引发衰老、各种疾病等。蜂胶黄酮具有清除自由基的作用。试验通过邻苯三酚自氧化法，邻二氮菲一Fe²⁺法和DPPH法评价其清除自由基的能力，比较蜂胶黄酮与VC、银杏黄酮等自由基清除剂的作用效果，为蜂胶的应用提供了一定的理论依据。

1材料与方法

1.1材料：蜂胶购于辽宁瓦房店。

1.2试剂：95%乙醇、硫酸亚铁、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、石油醚、亚硝酸钠、氢氧化钠、硝酸铝、乙酸乙酯、丙酮、VC、Tris、邻二氮菲、焦性没食子酸、过氧化氢、浓盐酸(以上均为分析纯)；芦丁(生化试剂)；银杏黄酮提取物。

1.3仪器设备：酒精计、RE-85C旋转蒸发器、722可见分光光度计、电子天平、干燥箱等。

1.4实验方法

1.4.1蜂蜡的去除

称取一定量的粗蜂胶，用滤纸包好后放入索氏抽提管中，以石油醚为提取剂，在60℃的水浴上提取5h~6h，取出滤纸包放于常温下使石油醚自行挥发干净。置于55℃的烘箱中烘1h后干燥皿中冷却0.5h，称重做差可得蜂蜡含量。

1.4.2乙醇回流提取

80%的乙醇在60℃回流提取2h~3h。冷却至室温，用真空泵抽滤两次。然后在温度为50~60℃下低压旋转蒸发器上浓缩，提取液备用^[3]。

1.4.3乙醇回流提取物的精制^[4]

量取一定量的乙酸乙酯，加入乙醇回流提取物中。待分层完全后收集乙酸乙酯萃取物，50~60℃的水浴上旋转燕发，提取液各用。

1.4.4超氧阴离子自由基的清除

在试管中加人pH7.2的0.05mol/L的Trs-HCI缓冲液3mL，加人0.2mL的乙醇提取液。于25℃保温10s加人同样预热的0.2mol/L的邻苯三酚溶液8mL，迅速摇匀倒人比色皿中，在325nm的波长处测定吸光度，每隔30s测定一次，反应时间为4min，滞后30s。计算每分钟吸光值的增加量，空白对照管的结果为邻苯三酚的自氧化率。以同样的方法测定pH分别为7.4、7.6、7.8、8.0、8.2的Tris-HCI缓冲液条件下0.2mL乙醇提取液对超氧阴离子自由基的清除效果，确定出最适pH。在最适pH的缓冲液条件下以同样的方法测定乙醇提取液加样量分别为0.4mL、0.6mL、0.8mL、1.0mL时对超氧阴离子自由基的清除效果。以同样的方法测定不同加样量的VC和银杏黄酮对超氧阴离子自由基的清除效果。

1.4.5羟基自由基的清除

取1mL0.75mmol/L邻二氮菲无水乙醇溶液于试管中，依次加人2mL0.2mol/L的磷酸缓冲液(pH=5.8、6.2、6.6、7.0、7.4、7.8)和0.2mL燕馏水，充分混匀，加人1mL新配制的0.75mmol/L硫酸亚铁溶液，混匀后加人!mL新配制的0.01%的双氧水，于37℃水浴加热60min后，在536nm测吸光值，所测得的吸光值为损伤管的吸光值。未损伤管以1mL蒸馏水代替损伤管中双氧水，操作方法同损伤管，可测得536nm未损伤管的吸光值。样品管以0.2mL样品代替损伤管中的蒸馏水，操作方法同损伤管，可测得536nm样品管的吸光值"。确定出最适pH。

以同样的操作方法测定最适pH下不同加样量(0.4mL、0.6mL、0.8mL、1.0mL)对羟基自由基的清除效果。VC和银杏黄酮对羟基自由基的清除效果的测定方法同上。

1.4.6 DPPH的清除

按表1所示加样顺序，在室温反应30min后，在520nm处测定各样品的吸光值。

以同样的操作测定加样量为0.4ml、0.6ml、0.8ml、1.0ml时对DPPH自由基的清除效果。以同样的方法测定VC和银杏黄酮对DPPH的清除效果。

2、结果与讨论

2.1对超氧阴离子自由基的清除效果

2.1.1不同pH蜂胶黄酮对超氧阴离子自由基的清除效果

图1不同pH蜂胶黄酮对超氧阴离子自由基的清除效果

由图1可知，蜂胶黄酮清除超氧阴离子自由基的最适pH为8.2。

2.1.2不同加样量对超氧阴离子自由基的清除效果

系列1为蜂胶黄静对超氧阴离子自由基的清除效果

系列2为VC对超氧阴离子自由基的清除效果

系列3为银杏黄静对超氧阴离子自由基的清除效果

图2不同加样量对超氧阴离子自由基的清除效果

由图2可以看出，对于超氧阴离子自由基的清除能力蜂胶黄酮>银杏黄酮>VC。同时，随着加样量的增加蜂胶黄酮、VC和银杏黄酮对超氧阴离子自由基的清除能力都上升。在加样量为0-0.4mL时，蜂胶黄酮对超氧阴离子自由基的清除能力呈明显的上升趋势，而后趋于平缓。银杏黄酮对超氧阴离子自由基的清除能力在加样量为0~0.6mL时呈明显的上升趋势。

2.2对羟基自由基的清除效果

2.2.1不同pH蜂胶黄酮对羟基自由基的清除效果

图3不同pH蜂胶黄酮对羟基自由基的清除效果

 

由图3可知在pH7.4蜂胶黄酮对羟基自由基有最高清除率。

2.2.2不同加样量对羟基自由基的清除效果

系列1为蜂胶黄酮对羟基自由基的清除效果

系列2为VC对羟基自由基的清除效果

系列3为银杏黄酮对羟基自由基的清除效果

图4对羟基自由基的清除效果

由图4可以看出对羟基自由基的清除效果蜂胶黄酮明显大于VC和银杏黄酮。而银杏黄酮对羟基自由基的清除能力>VC对羟基自由基的清除能力。三者对羟基自由基的清除能力都随着加样量的增加而加强，且蜂胶黄酮的羟基自由基的清除能力随着加样量的增加有明显的上升趋势。

2.3不同加样量对DPPH·的清除效果

图5对DPPH·的清除效果

由图5可以看出对于DPPH的清除能力蜂胶黄酮~银杏黄酮>VC。蜂胶黄酮和银杏黄酮加样量在0~0.4mL之间时，清除DPPH的能力呈明显的上升趋势，之后二者的清除能力随着加样量的增加趋于平缓。

3、结论

实验结果表明，蜂胶黄酮对DPPH自由基的抗氧化性能与银杏黄酮相当，但其对超氧阴离子及羟基自由基的抗氧化性能优于银杏黄酮。蜂胶黄酮的抗氧化性能明显优于VC。银杏黄酮的抗氧化性能也优于VC。因此，蜂胶黄酮是一种较好的抗氧化剂。各种抗氧化剂对自由基的清除能力都随着加样量的增加而增加。

参考文献

[1]柳学松，黄金岩.蜂胶黄副类化合物研究及应用[J].医药产业资讯，2006，301)：130~131.

[2]陈海光，叶丹杰，氧自由基及其清除剂[].仲凯农业技术学院学报，2002，15(1)：53~60.

[3]彭冬英，高萌瑜，周永兵，蜂蜡中黄酮提取工艺的研究[食品工业科技，2006，01)：118~120.

[4]汪秋安，周冰，单杨.天然黄酮类化合物的抗氧化活性和提取技术研究进展[J].化工生产与技术，115)30~31.

[5]金青哲，刘元法，王兴国等.芝麻素抗氧化性的初步研究口.中国粮油学报，2005，204)89~92.

[6]陈黎斌，杨严俊，刘晓君，醋蛋白水解液抗氧化活性的研究食品研究与开发，2006，27)41~43.