蜂蜜敷料治疗糖尿病足溃疡的可能性

糖尿病足是指与糖尿病局部神经功能异常和下肢远端外周血管病变相关的足部感染、溃疡和/或深层组织破坏，是糖尿病最严重的慢性并发症之一。2021年国际糖尿病足联合会估计全球目前有5.37亿成人（20～70岁）罹患糖尿病，预测到2035年糖尿病患病人数约有6.43亿，到2045年将高达7.83亿，而糖尿病患者一生中发生溃疡的概率高达19%～34%。

基于2015年国际糖尿病联合会的报告，每年将有910万～2610万人罹患糖尿病足溃疡（diabetic foot ulcers,DFU)，虽然2/3的DFU患者足部溃疡可逐渐愈合，但仍有28%的DFU会导致不同形式的下肢截肢，严重者甚至可导致患者死亡。罹患DFU的患者第一年死亡率为5%，第五年为42%。因此，预防DFU的发生以及形成溃疡后进行正确处理对于挽救患病肢体、避免截肢（尤其是大截肢）、保证患者生命安全尤为重要。

1 糖尿病足溃疡的治疗原则

DFU的管理方案包括血糖和感染控制、血管评估、伤口减压、手术清创，以及应用敷料使伤口保持湿润的环境并控制渗出液以促进创面愈合。

(1)血糖控制：血糖控制不佳容易引起血管、神经病变等慢性并发症，从而导致DFU的发生发展。血糖升高还可造成中性粒细胞功能异常，从而增加血管并发症及DFU发生感染的风险，进一步影响伤口愈合。

(2)血管评估：血管评估是预测伤口愈合的可能性及截肢平面的重要依据。此外，肢体缺血将使抗生素难以到达溃疡或感染部位，从而不能维持有效的局部作用浓度，不利于感染的控制。

(3)伤口减压：减轻足底压力和剪应力是DFU伤口护理的重要部分。足底剪应力是地面反作用力的水平分量，而垂直于足底的压力是DFU发生发展和伤口愈合不良的主要原因；伤口减压可促进伤口愈合并防止溃疡复发。减轻伤口压力的方法包括更换合适的鞋子、使用专用的靴子或矫形助行器等。

(4)感染控制：糖尿病患者由于下肢远端外周血管病变、周围神经病变或两者兼有，以及免疫反应方面尚未明确定义的缺陷（如中性粒细胞功能异常），导致其抗感染能力明显降低，一旦发生DFU，因皮肤的屏障功能丧失，极易造成细菌定植，进而发展为糖尿病足感染（diabetic foot infection,DFI）。40%～50%的DFU患者可发展为DFI，如果感染控制不佳，可迅速发展为蜂窝织炎、脓肿形成、骨髓炎和坏死性筋膜炎等。2016年，糖尿病相关的足部感染导致美国超过13万例患者下肢截肢，而截肢后的5年死亡率约为50%，超过了许多癌症的死亡率。故对DFU患者应加强感染控制，以减少相关并发症的发生，降低截肢率。

(5)手术清创：虽然抗生素是治疗DFI所必需的，但仅应用抗生素治疗通常不够，大多数患者还需要某种形式的外科手术干预，包括感染部位的紧急切开引流、坏死组织清创、血运重建或截肢以及随后的创面修复等。手术清创的目的是去除坏死组织，创造有利于创面愈合的微环境。一旦患者出现全身感染的症状和体征（发热、寒战、心动过速、低血压），应紧急进行手术清创治疗（如患者全身状况极差，至少应于床旁局部麻醉下行感染部位的切开引流术），以挽救患者的肢体和生命。

(6)创面外用药物及敷料：糖尿病足发生溃疡后，极易造成细菌定植；溃疡存在的时间越长，发生感染的风险越大。DFU作为一种慢性难愈性创面，可能会发生需氧/厌氧菌和革兰氏阳性/阴性菌等多重细菌的混合感染，生态系统内共生的不同种群的微生物可相互作用及影响，不同种类的毒力因子可通过群体感应（QS）作用在细菌之间传播，在创面感染时协同发挥致病作用，造成伤口局部和患者全身状况的恶化。大量研究表明，DFI常与生物膜有关，导致其治疗时选择适当的抗生素较为困难。

此外，生物膜还可阻碍创面中肉芽组织的形成和再上皮化进程，导致创面愈合困难。糖尿病患者的抗菌治疗可采用全身或局部给药。DFU急性感染时应采用全身用药，而一旦感染的临床症状和体征消失、创面形成肉芽组织屏障，则应停止全身应用抗菌药物，因为没有良好的证据支持其可加速伤口愈合或防止随后的感染，此时应改用创面外用药物（即伤口敷料），以最大程度地减轻细胞毒性作用及减少细菌耐药的发生。

2 创面外用药物及敷料

目前抗生素治疗在以下两个方面面临着日益严重的危机，即新药开发的减少和耐药菌株的增多。因此，临床医生可以而且应该采取一些行动来延缓甚至避免“后抗生素时代”（post-antibiotic era）的到来。临床上对于未感染的DFU创面应避免使用抗生素，而感染创面应在尽可能短的时间内使用窄谱抗生素完成治疗。近年来慢性DFU患者超广谱耐药菌（XDR）感染的发生率不断上升，导致肢体局部及全身感染的处理更加困难。

目前可用抗菌药物的最佳剂量已难以对抗超广谱耐药病原体，因此，增加伤口局部药物浓度、开发新的药物传递系统、研制新型多功能敷料、减少全身抗生素的使用等措施或许能为包括DFI在内的所有患者带来福音。局部抗菌治疗不仅可在伤口局部达到足够的抗菌浓度，避免全身用药引起的不良反应及肝肾毒性，而且可减少全身菌群的暴露，可能会减少耐药菌的产生。

尽管如此，基于对局部外用抗生素产生耐药菌的顾虑，除磺胺嘧啶银、磺胺嘧啶锌、莫匹罗星软膏、复方多黏菌素B软膏、夫西地酸软膏等可直接外用于创面外，其他抗生素多采用与药物传递系统结合的方式应用于创面，如聚甲基丙烯酸甲酯（不可降解）为载体的抗生素骨水泥链珠、硫酸钙（可降解）抗生素链珠、胶原蛋白绒（collagen fleece）抗生素片、壳聚糖-纳米羟基磷灰石-乙基纤维素-抗生素微球、抗生素纳米纤维片等。

常用与药物传递系统结合的抗生素包括氨基糖苷类、糖肽类、碳青霉烯类，如万古霉素、莫西沙星、达托霉素、庆大霉素、克林霉素、妥布霉素、亚胺培南等。蜂蜜及蜂蜜敷料的应用在国外也已有大量报道，主要用于Ⅰ度及Ⅱ度烧伤、供皮区、外伤及手术切口、腿部溃疡（静脉功能不全溃疡、动脉溃疡和混合病因的腿溃疡）、压疮、DFU等。下文将重点讨论蜂蜜敷料治疗DFU的可能性。

3 蜂蜜敷料

蜂蜜是蜜蜂采集花卉和其他植物的花蜜及分泌物后在蜂巢中加工、酿制出来的一种富含碳水化合物的糖浆。医用级蜂蜜多经γ射线辐照进行消毒，以破坏潜在的细菌孢子，同时保持其生物活性。1999年蜂蜜首次在澳大利亚注册为外用医疗制剂，此后，一系列以蜂蜜为基础的产品逐渐用于临床，包括无菌麦卢卡蜂蜜管和药膏以及蜂蜜浸渍敷料。蜂蜜的抗菌机制主要包括高糖、低p H值、释放H2O2、非过氧化物因子等。
蜂蜜含有多种抗菌成分，各成分可单独或协同发挥抗菌作用，体外抗菌实验证实蜂蜜对80多种微生物有效，且目前还没有发现致病微生物对蜂蜜产生耐药性。蜂蜜对致病微生物细胞的作用靶点包括隔膜蛋白、应激蛋白和膜蛋白，且蜂蜜对不同微生物有不同的作用方式。

蜂蜜本身的糖成分可通过机械手段防止细菌黏附到特定的物体表面，或者通过抑制细菌的群体感应和表面黏附物质的基因表达来抑制生物膜的形成或破坏已建立的生物膜。另外，蜂蜜与其他抗生素有协同作用，能恢复耐药菌对抗生素的敏感性。

蜂蜜是一种高渗透压的过饱和糖溶液。多数蜂蜜含糖量高达80%(W/V），而后者是蜂蜜中唯一特征明确的抗菌因子。正常情况下，细菌生长需要水活性（“游离”水量）为0.94～0.99，而蜂蜜的水活性较低，为0.56～0.62，远低于细菌生长所需的阈值，故可阻止细菌生长。另外，蜂蜜中高糖产生的高渗透压可从伤口中吸取液体，也能从细菌中提取水分，从而导致细菌脱水死亡。蜂蜜可直接涂布在伤口表面，在伤口和环境之间提供一个物理屏障，防止创面的细菌定植。蜂蜜中葡萄糖和果糖的抗黏附特性可阻止铜绿假单胞菌黏附至宿主细胞表面，从而防止其生物膜的形成。

在蜂蜜的产生过程中，蜜蜂会从下咽腺分泌葡萄糖氧化酶并添加到蜂蜜中。在成熟期间，由于缺乏游离水，蜂蜜中的葡萄糖氧化酶被灭活，但当蜂蜜被稀释时可恢复活性，葡萄糖氧化酶可将葡萄糖和水转化为葡萄糖酸（D-葡萄糖酸-δ-内酯）和H2O2，葡萄糖酸会降低蜂蜜的p H值。大多数微生物的适宜p H为7.2～7.4，而蜂蜜的p H为3.2～4.5，低p H可进一步抑制微生物的生长。

在20世纪60年代，H2O2被确定为蜂蜜中的主要抗菌化合物。H2O2的作用推测是在蜂蜜尚未成熟且糖浓度未达到一定水平时防止微生物生长，从而预防蜂蜜腐败。当蜂蜜涂在伤口时，由于其高渗作用而从伤口抽吸水分，使葡萄糖氧化酶更容易与葡萄糖结合并释放H2O2，该释放过程缓慢，使生成的H2O2能及时扩散，避免在局部积聚而对细胞产生毒性。不同产地或品牌的蜂蜜释放的H2O2量存在差异，可能与其葡萄糖氧化酶的活性不同有关。蜂蜜中H2O2的含量为溶菌所需水平的400～4000倍，但仅为3%H2O2溶液的1/1000左右，对人体细胞没有毒性。

H2O2可破坏细菌的细胞壁和细胞膜，使毒性物质易于进入细胞，并可使细胞内结构出现紊乱，甚至使芽孢的皮质消失；同时H2O2还可破坏细菌的氨基酸、酶和DNA，特别是可抑制含SH基酶的活性，导致DNA核苷酸链断裂及其碱基组成改变，从而抑制或杀灭细菌。H2O2在过渡金属离子（Fe2+/Cu2+）的参与下，可通过Fenton反应分解形成羟自由基（·OH），后者的抗菌作用更强，不仅能破坏蛋白质、酶、脂质和多聚糖，而且可引起DNA降解。通常情况下，多酚具有较高的氧自由基淬灭能力，是有效的抗氧化剂。但是当多酚被氧化时，则可成为强大的促氧化剂。氧化多酚进一步生成H2O2，通过Fenton反应生成·OH，从而导致细菌生长停滞和DNA降解。

蜂蜜具有Fenton反应所需的所有底物：H2O2、多酚以及过渡金属离子。BRUDZYNSKI等认为蜂蜜是通过多酚/H2O2诱导的氧化应激反应而发挥抑制细菌和损伤DNA的作用的。蜂蜜对细菌的氧化应激作用可能是由·OH而非H2O2本身引起的，除·OH外，初始Fenton反应产生的其他自由基也可能具有协同作用。

蜂蜜基于·OH的作用对抗生素敏感菌和耐药菌具有同样的抑菌作用。但Manuka蜂蜜在应用H2O2酶去除H2O2后，仍可使细菌DNA降解，抗菌活性没有明显变化，表明H2O2并不是蜂蜜中唯一的抗菌成分。

Manuka蜂蜜对多种细菌（包括耐药菌）具有抗菌活性。2008年ADAMS等采用高效液相色谱法在新西兰Manuka蜂蜜中分离出非过氧化物抗菌活性成分甲基乙二醛（methylglyoxal,MGO),49份样品中其含量为38～828mg/kg。同年MAVRIC等也发现新西兰Manuka蜂蜜含有1,2-二羰基化合物3-脱氧葡萄糖（1,2-dicarbonyl compounds 3-deoxyglucosulose,3-DG）、乙二醛（glyoxal,GO）和MGO三种成分；琼脂孔扩散法分析显示，MGO对大肠埃希菌和金黄色葡萄球菌的最低抑菌浓度（minimum inhibitory concentration,MIC）均为1.1mmol/L,GO对大肠埃希菌和金黄色葡萄球菌的MIC分别为6.9mmol/L和4.3mmol/L，而3-DG在高达60mmol/L的浓度下仍未表现出抑菌作用，提示新西兰Manuka蜂蜜的抗菌活性来自于MGO。

研究显示，MGO能有效抑制革兰氏阳性菌（对枯草芽孢杆菌的MIC为0.8mmol/L，金黄色葡萄球菌的MIC为1.2mmol/L）和革兰氏阴性菌（对铜绿假单胞菌的MIC为1.0mmol/L，大肠埃希菌的MIC为1.2mmol/L）的生长。MGO对铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的生物膜也有效，但其有效浓度明显高于抑制浮游细菌所需的浓度。MGO是一种高度亲电的分子，可与DNA和蛋白质（如质膜蛋白）结合，改变蛋白质的结构、功能，导致细胞膜通透性发生变化，从而引起细菌溶解。

细菌菌毛具有重要的附着功能，在细菌之间、细菌与宿主之间的黏附以及细菌附着于固有物表面等方面发挥作用，而鞭毛为细菌提供了一个推进系统，可使细菌在液体中游动，并通过趋化、黏附、侵入宿主表面及释放毒力因子等影响细菌的毒力。ROBERTS等发现Manuka蜂蜜可抑制铜绿假单胞菌的聚集和游动，降低鞭毛蛋白和鞭毛蛋白相关基因fli A、fli C、flh F、fle N、fle Q、fle R的表达。RABIE等观察到MGO浓度增加可导致菌毛和鞭毛减少，2mmol/L的MGO可使菌毛和鞭毛全部消失，并导致细胞膜损伤；除影响基因表达和鞭毛运动外，MGO还可直接与菌毛和鞭毛蛋白（如Fim A/Pap A和flagellin）结合，导致二者结构完整性及功能的丧失。

与浮游细菌不同，细菌生物膜由大约80%的胞外聚合物（EPS）基质和大约20%的细菌细胞组成。EPS由多糖、蛋白质和核酸组成，不同细菌形成的EPS在p H值、电荷、离子强度、物理化学结构（线性、螺旋状）等方面存在较大差异，具有明显的特异性。亚抑制浓度（10%）的蜂蜜能显著减少奇异变形杆菌和阴沟肠杆菌的生物膜形成，而50%浓度的蜂蜜可完全杀死奇异杆菌生物膜中的细菌细胞，但阴沟杆菌生物膜中仅观察到活细胞部分减少，这可能与EPS基质的特定成分减少了MGO对阴沟肠杆菌生物膜的渗透作用，或通过解毒或修饰作用抑制了MGO的抗菌活性有关。

蜂蜜的抗菌活性不仅限于杀菌作用，还破坏了群体感应、生物膜形成和毒力因子的表达。研究显示，Manuka蜂蜜可导致金黄色葡萄球菌中12种参与核糖体功能、蛋白质合成、代谢过程和转录作用的蛋白发生差异表达，同时与毒力、群体感应、三羧酸循环和细胞分裂相关的基因表达减少，并可见毒力基因和全局调控基因的表达下调，表明蜂蜜具有独特的、多维度的抗菌作用模式。

抗菌肽（antimicrobial peptides,AMPs）是无脊椎动物先天免疫系统组成部分，在防御致病微生物侵袭中具有重要作用。蜜蜂实验性感染大肠埃希菌后，可在血淋巴（蜜蜂的血液系统）中产生4种类型的AMPs，即hemenoptecin、defensin-1、apidaecin和abaecin，每一种都具有独特的抗菌活性谱，且这些AMPs共同覆盖了所有主要类别的致病微生物。

Revamil蜂蜜是一种在温室中标准化条件下生产的医用级蜂蜜，具有明确、可重复的杀菌活性，2010年KWAKMAN等在该蜂蜜中发现了蜜蜂防御素-1(defensin-1），后者是一种阳离子抗菌肽，可在蜜蜂的血淋巴、蜂王浆和胸腺中检测到，对金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌具有明确的抗菌作用。虽然蜜蜂防御素-1的作用机制尚未完全阐明，但来自其他物种的防御素蛋白已被证实可使细菌细胞膜通透性发生改变，从而导致细胞死亡，且防御素导致的细菌细胞膜通透性增加与RNA、DNA、蛋白质合成抑制及细菌活力降低程度一致。

多酚是一组不同的化学物质，包括黄酮类化合物和酚酸，作为植物的次生代谢产物，这些具有生物活性的化合物可由蜜蜂从植物转移到蜂蜜中。一般而言，多酚的浓度与蜂蜜的颜色有关，通常颜色越深的蜂蜜黄酮类化合物和酚酸的浓度越高。蜂蜜中的多酚类化合物具有抗菌活性且与其含量呈正比，而不同植物来源的蜂蜜多酚含量存在明显差异，因此可影响其抗菌能力。多酚能破坏自由基及抑制氧化过程，并参与了H2O2的生成。

蜂蜜酚类提取物对金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌具有抗菌作用。多酚类化合物可通过氧化应激产生活性氧引起膜通透性改变及膜损伤，或通过与细胞膜双层脂质结合以及灭活或抑制胞内外酶的合成而破坏细菌细胞膜，造成细胞膜的通透性增加，导致细胞质和核苷酸渗漏，从而对金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌发挥抗菌作用。黄酮类化合物还可通过抑制DNA回旋酶、细胞质膜功能和能量代谢等多种机制发挥抗微生物作用。

不同来源的蜂蜜抗菌成分及其含量不同，因此对不同微生物的敏感性及抗菌活性也存在差异。如Manuka蜂蜜的主要抗菌成分是MGO，而Revamil蜂蜜含有相对较高水平的蜜蜂防御素-1和H2O2，仅含少量的MGO，两种蜂蜜对大肠埃希菌具有相同的抗菌活性，但前者对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌和铜绿假单胞菌的抗菌活性是后者的2～4倍，且金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌对Manuka蜂蜜的敏感性要高于大肠埃希菌和铜绿假单胞菌。研究发现，蜂蜜的抗菌作用不能归因于单一化合物，而是由复杂的化合物组合所致，这些化合物共同发挥作用，产生协同抗菌活性。此外，蜂蜜的抗菌作用虽然比传统防腐剂要慢得多，但其即使在稀释后仍能保持杀菌活性。

蜂蜜所表现出的广泛抗菌活性，尤其是对耐药菌的作用，导致了其与抗生素的协同作用逐渐引起了重视。目前已经探索了多种抗生素与蜂蜜的组合，并取得了一些有希望的结果。JENKINS等发现，亚抑制浓度的Manuka蜂蜜与苯唑西林联用可恢复耐甲氧西林金黄色葡萄球菌对苯唑西林的敏感性。另有研究发现，Manuka蜂蜜与四环素、亚胺培南或莫匹罗星联用对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌均具有协同杀菌作用，利福平、四环素或多黏菌素与Manuka蜂蜜联用对铜绿假单胞菌也具有协同杀菌作用。蜂蜜与其他多种抗生素及噬菌体联用也取得了相似的效果。

总之，感染是创面愈合的重要障碍，也是糖尿病患者下肢截肢的危险因素。蜂蜜的抗菌活性有助于防止创面的细菌定植及随后的生物膜形成，且对已形成生物膜的细菌也有抑制或杀灭作用，可预防创面感染或减轻创面感染的严重程度，间接促进创面愈合，将其用于伤口敷料有望在DFU的治疗中发挥重要作用。

（来源：中国医刊. 2022,57(12)， 蜂蜜敷料治疗糖尿病足溃疡的可能性，胡骁骅，北京积水潭医院烧伤科）