蜂胶可吸收成分对胰岛细胞的作用

【摘要】目的:观察蜂胶对胰岛细胞中胰岛素的合成及分泌的影响,研究蜂胶预防及治疗糖尿病的作用机制。方法:大鼠灌胃蜂胶提取物30 min后,腹主动脉取血,离心制备含蜂胶血浆。断颈处死大鼠,取出大鼠胰岛组织,消化处理并体外培养胰岛细胞。分别给予蜂胶含药血浆大、中、小剂量,运用ELASA法测定胰岛细胞内及胰岛细胞外的胰岛素浓度的变化。结果:各浓度的含蜂胶血浆能明显升高胰岛细胞外的胰岛素浓度(P<0.05);中、高浓度含蜂胶血浆能明显升高胰岛细胞内胰岛素浓度(P<0.05)。结论:蜂胶可吸收成分可明显促进胰岛细胞中胰岛素的合成及分泌,达到明显的降低血糖作用。

【作者】 张奇峰  周威  尹美珍  程清洲

【关键词】蜂胶 可吸收成分 胰岛细胞 胰岛素

糖尿病是因动物体内胰岛素绝对或相对不足而引起体内糖代谢紊乱的一种疾病,是继恶性肿瘤、心脑血管病后的第三位慢性非传染性疾病,严重威胁着人类的健康^[1]。近年来,国内外学者对蜂胶(Propolis)在预治糖尿病方面的应用进行了探索,确定了蜂胶的降血糖功能^[2]。现有资料中细胞水平的中药降糖研究主要集中在中药(包括复方)原料及不同提取物对不同体外细胞的作用,而没有考虑到中药(包括复方)的口服吸收过程。作为口服保健品,蜂胶降糖功效成分被人体吸收代谢后才能发挥作用。现代研究证明,不是所有的化学成分都可以被人体吸收,保健食品中发挥人体内保健作用的物质基础必定存在于被人体内吸收的化学成分群中;发挥功效的化学成分与摄入前化学成分相比,从结构类型和比例等都可能有重大变化。本次研究以大鼠灌服蜂胶后,以代表其可吸收成分群的血浆为研究对象,研究其对大鼠胰岛细胞内、外的胰岛素浓度的影响,科学地揭示蜂胶可吸收成分的降血糖机制。

1 材料

KQ-500DE型超声波清洗器(江苏昆山超声仪器公司);RE-52AA旋转蒸发仪(上海亚荣公司);凯达TGL-20LM台式高速冷冻离心机(湖南凯达科学仪器公司);DMEM高糖培养基、新生牛血清均购自GIBCO公司;CO2培养箱(长沙华曦电子科技有限公司);倒置相差显微镜CK-40(日本O-lympus公司);全自动洗板机(北京普朗新技术有限公司);全自动酶标仪(北京普朗新技术有限公司);大鼠胰岛素(INS)ELASA试剂盒(武汉华美生物有限公司,批号G12130144)。

健康SD大鼠,华中科技大学同济医学院实验动物中心提供,许可证号为SCXK(鄂)2004-0007。蜂胶原料采自湖北省神农架林区,由武汉市小蜜蜂有限公司提供,购自神农架玉泉绿色产品有限公司,经武汉工业学院生物及制药工程学院陈平教授鉴定为蜂胶。蜂胶提取物按文献^[3]方法制备。

2 方法

2.1 含蜂胶血浆的制备

蜂胶提取物按文献^[3]方法进行制备,将块状蜂胶粉碎过20目筛,称取50 g,加入1 L食用酒精(95%),润湿浸泡24 h,超声提取30 min,抽滤;滤渣再加入1升食用酒精,浸泡24 h,超声提取30 min,抽滤。根据2010年版中国药典^[4]成人剂量0.2～0.6 g·(60 kg)-1折算成大鼠剂量,取SD大鼠灌胃剂量为60 mg·kg-1;每只每日2次,连续3 d,对照组给以同剂量的生理盐水。末次灌胃前禁食12 h。末次灌胃45 min后,腹主动脉采血,静置,3 000 r·min-1离心半径时间分离血浆,置-20℃保存备用。

2.2 胰岛细胞提取

根据文献^[5]方法进行试验。将大鼠断颈处死,酒精消毒,剪开腹腔并剪取胰腺,洗涤除去表面可见的膜并剪成1 mm3左右块状。将上述小块转入离心管中,加入2 mL胶原酶(0.5 mg·mL-1),并在38℃恒温水浴锅振摇消化15 min后,吸出上层消化液转入另一离心管中,并加入9mL冷Hanks与1 mL血清终止消化。将终止消化后所得的细胞液于低温离心机离心(1 000 r·min-1,2 min)。离心后,将上层液体倒去,底层细胞加入Hanks液洗涤1～2次。将消化所得细胞混合在一起离心,倒去上层液体,沉淀物加25%Ficoll-400溶液4 mL混匀,其上依次分别加入23%,20%,11%Ficoll-400溶液和Hanks液各2 mL,3 000 r·min-1,4℃离心20 min,吸出胰岛细胞,用4℃Hanks液于50 mL离心管离心洗涤2次。将上述所得胰岛细胞加入6 mL1640培养液,并转入培养瓶于CO2培养箱培养备用。

2.3 胰岛素测定

2.3.1 胰岛细胞胰岛素分泌测试

根据文献^[6],在含蜂胶血浆及空白血浆与胰岛细胞共同培养一段时间后,运用ELASA法测定细胞内外胰岛素的含量。将提取的胰岛细胞接种于24孔培养板,每孔1 mL胰岛细胞悬液。设空白血浆对照组和低、中、高3个含蜂胶血浆组;蜂胶组加入“2.1”项制备的样品血浆溶液分别为10,15,20μL·mL-1,对照组分别加入相应剂量的空白血浆溶液,37℃,5%CO2培养箱中培养48 h后,收集各孔细胞培养上清液。按照大鼠胰岛素ELISA试剂盒操作说明,使用酶标仪建立标准曲线,并检测胰岛细胞培养上清液中胰岛素(即胰岛细胞分泌至细胞外的胰岛素)的含量。

2.3.2 胰岛细胞胰岛素内产生量测定根据文献^[7],加d-hanks缓冲液洗涤3次,加入裂解液裂解细胞,收集,按照大鼠胰岛素ELISA试剂盒操作说明,建立标准曲线并使用酶标仪检测胰岛素(即胰岛细胞内胰岛素)的含量。

2.4 数据统计

应用SPSS17.0软件对实验数据进行分析,各变量均以x珚±s表示,组间比较采用t检验。

3 结果

3.1 胰岛细胞体外培养结果见图1。

图1胰岛细胞团(A)和胰岛细胞团双硫腙的染色光镜照片(40×10)(B)

Fig 1 Pictures of islet cell clusters(A)and light microscopy(40×10)of islet cell clusters by Dithizone staining

3.2 含蜂胶血浆对胰岛细胞胰岛素分泌的影响运用“2.3.1”项下方法,建立的胰岛素含量标准曲线为:Y=0.001 X+0.0286。测试结果见表1。

表1胰岛细胞外胰岛素含量

Tab 1 Insulin concentration of extracellular islet cell

3.3含蜂胶血浆对胰岛细胞内胰岛素含量的影响运用“2.3.2”项下方法,测试结果见表2。

表2胰岛细胞内胰岛素含量

Tab 2 Insulin concentration of intracellular Islet cell

根据表1及表2可以看出,与对照组相比,各种剂量蜂胶血浆组均能促进胰岛素的分泌(P<0.01);针对胰岛素的细胞内含量,小剂量(10μL·mL-1)没有增加胰岛素合成的效应,反而细胞内含量明显降低,而大剂量(40μL·mL-1)明显促进胰腺细胞内胰岛素的合成,细胞内含量明显高于对照组。

4 讨论

根据已有文献及本课题组前期的研究成果,蜂胶能明显降低糖尿病模型小鼠的空腹及餐后血糖^[8]。本研究分析了大鼠灌胃蜂胶后取出的血浆对体外培养的胰岛细胞的胰岛素合成及分泌的影响。从实验结果可知,含蜂胶血浆能明显增加胰岛细胞外胰岛素的含量,即增加胰岛素的分泌;而大剂量(40μL·mL-1)能明显增加细胞内胰岛素浓度,即胰岛素的合成。结果证明,蜂胶降糖的有效途径包括对胰岛细胞的作用,通过调高血液中胰岛素浓度而达到降糖目的。通过比较表1及表2,胰岛素分泌的剂量依耐性(胰岛素高剂量平均值/对照值=236.41/185.41=1.28)明显低于胰岛素合成的剂量依耐性(胰岛素蜂胶血浆高剂量平均值/对照值=44.68/26.58=1.68);此说明蜂胶提取物对胰岛素合成的影响明显强于其对胰岛素分泌的影响,此结果对糖尿患者血糖的控制有积极意义。

蜂胶作为一种具有明显降糖作用的天然药物和保健食品,既克服了中药疗效缓慢的缺点,对患者身体的毒副作用又小;因此我们要深入研究蜂胶的有效核心成份,及其在防治糖尿病等系列功能的研究。整体动物实验结合含药血浆的体外实验结果,能有效地阐述营养物质的功效及其途径,此种研究方案值得在今后的营养品研究中推广。

参考文献：

[1]Expert Committeeonthe Diagnosisand Classification of DiabetesMellitus.Report of theexpert commtteeon the diagnosis andclass if iction of diabete smellitus[J].Diabetes Care,2003,26:S5-S20.

[2]郦金龙,赵文婷,王盼,等.蜂胶的研究应用进展[J].中国食物与营养.2011,17(6):20-24.

[3]周威,程清洲,陈新,等.浙江桐庐产蜂胶中黄酮类化合物研究[J].中华中医药杂志,2013,28(2):394-397.

[4]中国药典.一部[S].2010:336.

[5]黄任平,宋纯,张增岭,等.3D自组装肽纳米纤维支架对胰岛细胞分泌功能的影响[J].中国组织工程研究与临床康复,2011,15(42):7863-7867.

[6]宋军,赵林华,姬航宇,等.开郁清热方对脂联素及胰岛分泌的影响[J].北京中医药,2011,30(4):310-312.

[7]宋琳亮,傅江南.接骨木多糖对大鼠胰岛细胞增殖及胰岛素分泌的影响[J].中国药理学通报,2011,27(11):1593-1596.

[8]程清洲,瞿永华,周威,等.鄂西地区蜂胶提取物调节血糖作用研究[J].中国民族民间医药,2013,22(2):31-33.