6种蜂蜜的抗氧化和抑菌活性研究

近年来，随着抗生素的滥用，越来越多的细菌产生耐药性，这对全世界公共卫生是一个巨大的挑战。蜂蜜复杂的化学成分使得其具有抗氧化、抑菌、抗炎、抗肿瘤等多种生物学活性。多项研究表明蜂蜜可以作为一种替代或补充的抑菌方法。

蜂蜜的化学成分受植物来源、地理来源、蜂种来源、气候条件、加工方式等因素影响。正因如此，蜂蜜可以作为一种强大的抗菌剂，甚至其抑菌和杀菌作用可以媲美抗生素。研究表明过氧化氢是大多数蜂蜜的主要抑菌成分，过氧化氢通过解离出具有高活性的羟基自由基抑制微生物的生长。蜂蜜中过氧化氢是葡萄糖氧化酶氧化葡萄糖过程产生的，此外多酚自氧化等也可产生过氧化氢。除过氧化氢外，蜂蜜的渗透压、pH、酚酸、黄酮、王浆主蛋白、抗菌肽、丙酮醛等也是蜂蜜发挥抑菌作用的因素。Zhang 等研究国产9 种蜂蜜的抗氧化和抑菌活性，结果发现茴香蜜、藿香蜜和石榴蜜抗菌和抗氧化活性均较好，具有进一步开发的潜力。Anand 等研究表明藿香蜜在40% 浓度下具有良好的抑制白色念珠菌及皮肤真菌的作用。目前研究表明沙枣蜜、神农架蜂蜜、石榴蜜和苹果蜜均具有良好的抗氧化活性，但是缺少抑菌活性的评价。

我国幅员辽阔，蜜粉源植物丰富，蜜蜂采集植物的花蜜或分泌物并经充分酿造后形成了各具特色的蜂蜜。本研究收集国内6 种不同植物来源的蜂蜜，通过测定蜂蜜样品的抗氧化能力以及蜂蜜样品对金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）和大肠杆菌（Escherichia coli）的抑菌效果，以期发掘具有良好抑菌活性的蜂蜜，为特色蜂蜜的开发提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

本研究共收集6 种不同植物来源的蜂蜜，具体信息见表1。所有蜂蜜样品避光保存在-20℃冰箱直至分析。

S. aureus ATCC 29213、E. coli ATCC 25922（ 上海北诺生物科技有限公司），没食子酸、福林酚（上海麦克林生化科技有限公司），无水碳酸钠、氯化钠、可溶性淀粉、碘化钾、乙酸（国药集团化学试剂有限公司），DPPH（ Sigma 公司），总抗氧化能力检测试剂盒（ FRAP 法）（上海碧云天生物技术有限公司），过氧化氢定量分析试剂盒（水兼容性）、LB 肉汤培养基［生工生物工程（上海）股份有限公司，营养琼脂（北京索莱宝科技有限公司）。

1.2 仪器与设备

手持式折射仪（北京万成北增精密仪器有限公司，WZ-116ATC），pH 计［梅特勒- 托利多仪器（上海）有限公司，EL20］，岛津分光光度计（日本岛津有限公司，UV-2550），全波长酶标仪（美国伯乐公司，Model 550），气浴恒温振荡器（上海博迅实业有限公司医疗设备厂，THZ-92A）。

1.3 试验方法

1.3.1 基本理化指标

在室温下，用手持式折射仪测定蜂蜜样品的含水量。准确称取20.0g 蜂蜜样品并用蒸馏水定容至100mL，在20℃用电导仪测定其电导率，结果用 μS/cm表示。准确称取10.0g 蜂蜜样品，溶解在75mL 蒸馏水中，在25℃用pH 计测定样品的pH 值。采用分光光度法测定蜂蜜中淀粉酶活性，将淀粉溶液和蜂蜜缓冲溶液在40℃水浴，淀粉酶活性表示为1g 蜂蜜在1h内水解1% 淀粉的毫升数，单位用mL/(g·h) 表示。蜂蜜中蛋白质含量的测定参考Zhang 的方法，用牛血清白蛋白作为标准。

1.3.2 总酚含量

采用福林酚（Folin-Ciocalteu） 比色法测定蜂蜜总酚含量。取0.5mL 蜂蜜溶液（0.2g/mL）与2.5mL 福林酚试剂（0.2mol/L）混匀静置5 min，然后加入2mL 的Na2CO3 溶液（0.1g/mL） 并定容至10mL，避光静置反应2h 后，在波长725nm 处测定吸光度值。以蒸馏水为空白对照，以没食子酸含量（0.04~0.24mg/mL）为横坐标，吸光度值为纵坐标绘制标准曲线。结果表示为每100g 蜂蜜中没食子酸标准品当量（mg GAE/100g）。

1.3.3 抗氧化能力测定

1.3.3.1 DPPH 自由基清除能力测定

参考Turkmen的方法， 并做适当修改。将100μL 蜂蜜样品溶液（0.2g/mL）与100μL DPPH 乙醇溶液（0.08mg/mL，现配现用）混合均匀，室温下避光反应 30min，于 517nm 波长处测定吸光度。以维生素C 浓度（5~50μg/mL）为横坐标，吸光度值为纵坐标绘制标准曲线。结果表示为mg Vc/100g。

将7.5mL 7mmol/L ABTS 溶液和132μL 140mmol/L 过硫酸钾溶液室温避光反应16h，制得ABTS 母液。

在使用前，把ABTS 母液用蒸馏水稀释成ABTS 工作液（要求ABTS 工作液吸光度减去相应的蒸馏水空白对照后，A734 为0.7±0.05）。取5μL 蜂蜜样品溶液（0.2g/mL）加入200μL ABTS 工作液，空白对照加入5μL 蒸馏水。室温避光孵育6min 后测定734nm 处的吸光度值。以Trolox 溶液（0.1~1.3mM）为横坐标，吸光度值为纵坐标绘制标准曲线。结果表示为每kg蜂蜜中Trolox 当量（mmol Trolox/kg）。

1.3.3.3 铁离子还原/ 抗氧化能力（FRAP）的测定

采用总抗氧化能力检测试剂盒（FRAP 法）检测蜂蜜抗氧化能力。5μL 0.2g/mL 蜂蜜溶液中加入180μL FRAP 工作液，37℃孵育5min 后，在593nm测定吸光度。以Trolox 溶液（0.05~1.3mM）为横坐标，吸光度值为纵坐标绘制标准曲线。结果表示为每kg蜂蜜中Trolox 当量（mmol Trolox/kg）。

1.3.4 抑菌能力测定

1.3.4.1 琼脂扩散法

参考Zhang的方法并适当修改。用灭菌的蒸馏水稀释蜂蜜样品至50%（w/v）。将25mL 的营养琼脂培养基铺于75mm 的培养皿中，待冷却凝固后，使用LB 肉汤培养基将菌液稀释至1×106 CFU/mL，每培养板涂布100μL 稀释后的菌液。使用打孔器于培养基上均匀打四个孔（直径为8mm），然后在孔中加入150μL 待测蜂蜜稀释液或阴性对照（无菌水）、阳性对照（10% 苯酚溶液），并将培养皿置于恒温培养箱中正置37℃培养18h，最后使用游标卡尺以十字交叉法测量抑菌圈的直径（mm）。

1.3.4.2 肉汤稀释法

采用肉汤稀释法测定蜂蜜样品的最低抑菌浓度（minimum inhibitory concentration，MIC）和最低杀菌浓度（minimum bactericidal concentration，MBC）。

用LB 肉汤培养基配置不同浓度的蜂蜜样品（50%、25%、 20%、 12.5%、 10%、 6.25%、5%、3.125%、2.5%、1.25%）， 并将菌液稀释至1×106CFU/mL。被测蜂蜜溶液和菌液按9 ∶ 1 的比例混合，100μL 混合液体加入96 孔细菌培养板（空白组以培养基代替蜂蜜溶液），并在600nm 处测定吸光度，记为T0。然后将培养板置于37℃培养24h，取出测其600nm 处的数值记为T18。细菌的抑制率公式为: 抑制率/%=1- ( 实验组T24- 实验组T0) / ( 空白组T24- 空白组T0) ×100%。

取MIC 试验中无细菌生长的20μL 悬液在营养琼脂平板上培养，37℃孵育24h，无细菌生长的最低浓度为MBC。

1.3.5 过氧化氢含量测定

参考zhang的方法，配置50%（w/v）的蜂蜜溶液用过氧化氢定量分析试剂盒（水兼容性）测定蜂蜜中过氧化氢的含量。

1.4 数据处理

所有蜂蜜样品均测定3 个平行，结果以平均值（Mean）± 标准差（SD）表示。采用Tukey 检验法分析各组数据间的差异显著性（p ＜ 0.05）。

2 结果与讨论

2.1 基本理化指标分析

从表2 可以看出， 神农架蜂蜜具有最高的pH 值（4.62±0.01）。蜂蜜的电导率与灰分和酸度相关。除神农架蜂蜜外，本研究中其他蜂蜜的电导率均符合标准 规定的蜂蜜的电导率不超过0.8mS/cm。

试验测得6 种蜂蜜的总蛋白含量为4.06~6.65mg/g，其中蒲公英蜜的总蛋白含量显著高于其他5 种蜂蜜（p ＜ 0.05）。蜂蜜的总蛋白含量主要与蜂蜜的酿造时间和酿造程度有关。淀粉酶常被用来表征蜂蜜的新鲜度及加工程度。本研究中6 种蜂蜜的淀粉酶值为13.55~37.07mL/(g·h)，均达到相关标准规定的不低于8mL/(g·h)。沙枣蜜的淀粉酶活性显著高于其他5 种蜂蜜（p ＜ 0.05）。

2.2 总酚含量及抗氧化能力分析

研究表明蜂蜜的总酚含量与其抗氧化能力明显相关。6 种蜂蜜的总酚含量和抗氧化能力见表3。本研究中所有蜂蜜样品的总酚含量为128.64~360.40mgGAE/kg，其中神农架蜂蜜的总酚含量（360.40±6.36mgGAE/kg）显著高于其他5 种蜂蜜。不同种类的蜂蜜的总酚含量具有明显差异，这主要与蜜蜂采集的蜜源植物有关。DPPH 自由基、ABTS+·自由基清除能力和FRAP 总抗氧化活性是3 种常用来评估蜂蜜体外抗氧化能力的方法，且这3 种方法的重现性和稳定性均良好。DPPH 自由基清除实验表明神农架蜂蜜具有最高的抗氧化活性（13.14mg Vc/100g），其次是苹果蜜（10.45mg Vc/100g）。6 种蜂蜜对ABTS+·自由基的清除能力最高的是神农架蜂蜜，苹果蜜的抗氧化能力显著高于狼牙刺蜜和石榴蜜。

FRAP 总抗氧化能力测定结果显示神农架蜂蜜的抗氧化能力最高（0.92±0.07mmol Trolox/kg）， 其次是苹果蜜（0.78±0.04mmol Trolox/kg） 和蒲公英蜜（0.33±0.01mmol Trolox/kg）。3 种抗氧化能力评价方法得出的结果基本一致，即神农架蜂蜜的抗氧化活性最好，苹果蜜次之。

2.3 抑菌活性及过氧化氢含量分析

我们采用琼脂扩散法和肉汤稀释法来评价蜂蜜对S. aureus 和E. coli 的抑菌能力并且测定了蜂蜜中过氧化氢的含量。琼脂扩散试验（表4）表明所有蜂蜜样品均未对E. coli 产生抑菌圈，而对S. aureus 都产生了超过11mm 的抑菌圈。Zhang 等研究结果同样表明9 种单花蜜均未对E. coli 产生抑菌圈，对S. aureus 则均产生明显的抑菌圈，造成这种差异的原因可能是由于两种细菌细胞壁的组成不同。不同植物源蜂蜜对S. aureus 的抑菌能力不同，苹果蜜（16.87±0.80 mm）和神农架蜂蜜（16.31±0.74mm）产生的抑菌圈显著高于其他4 种蜂蜜（p ＜ 0.05），沙枣蜜、狼牙刺蜜和石榴蜜抑菌圈无显著差异，产生最小抑菌圈的则是蒲公英蜜（11.08±0.21mm）。6 种蜂蜜的H2O2 含量为159.10~482.28μmol/g，沙枣蜜（482.28±25.56μmol/g）的过氧化氢含量显著高于其他蜂蜜（p ＜ 0.05），其次是神农架蜂蜜（388.16±8.73μmol/g），而蒲公英蜜、苹果蜜、狼牙刺蜜和石榴蜜差异不显著。我们研究中沙枣蜜的H2O2 含量最高，但是其抑菌能力却并不是最好的，类似的苹果蜜的抑菌活性最高，但是其H2O2含量却并不高。Bucekova 等研究同样表明在某些情况下，蜂蜜样品表现出高抗菌活性，同时生成低水平的H2O2，反之亦然。虽然H2O2 是蜂蜜的主要抑菌成分，但是总的抑菌效果还受渗透压、酸度、pH、多酚、黄酮、抗菌肽、王浆主蛋白等因素的影响。由于蜂蜜的成分复杂，各成分的抑菌效果及其相互的作用机制目前还不清楚。

肉汤稀释法（表5）结果表明苹果蜜对S. aureus的MIC（MIC50：0~1.25% w/v，MIC90：3.125%~5% w/v）和MBC（3.125%~5% w/v）最低，而石榴蜜相比其他蜂蜜对于E. coli 的MIC（MIC50：2.5%~3.125% w/v，MIC90：12.5%~20% w/v）最低。MIC 和MBC 结果表明蜂蜜对革兰氏阳性菌的抑制效果比革兰氏阴性菌更好，这与Goslinski 研究的结论一致。

3 结论

本研究收集国产6 种特色蜂蜜，并对其基本理化指标、抗氧化和抑菌活性进行测定和分析。结果表明，不同植物来源的蜂蜜的抗氧化和抑菌活性有明显差异，蜂蜜的抗氧化活性与总酚含量有关，其中神农架蜂蜜的总酚含量和抗氧化活性最高，苹果蜜对S. aureus的MIC（MIC50：0~1.25% w/v，MIC90：3.125%~5%w/v） 和MBC（3.125%~5% w/v） 最低， 而石榴蜜对E. coli 的MIC（MIC50：2.5%~3.125% w/v，MIC90：12.5%~20% w/v）最低。对不同植物来源蜂蜜的品质和活性评价，为进一步开发特色蜂蜜奠定良好基础。