蜂胶活性成分抗肝细胞氧化损伤及凋亡机制研究

近年来各型肝病严重威胁着人类的健康和生活水平，已经成为世界公共健康问题。对肝损伤的防治一直是国内外学者研究的一个热点，开发和鉴定具有保肝功效的药物和功能性食品是十分有必要的。蜂胶是一种天然活性物质，具有抗氧化、抗癌、抗菌、抗病毒等生物活性，在肝损伤的预防和治疗方面也有一定的效果。

以蜂胶保肝活性为依据，从山东蜂胶中分离筛选出具有保肝活性的化合物，并对活性化合物保肝活性的分子机制做初步研究，为蜂胶防治肝病的应用提供物质基础和理论数据。

以CCK-8法测定L-02肝细胞相对存活率为指标，确定了 150μM的过氧化氢损伤4h为最佳细胞损伤模型，并对杨树型蜂胶(山东)分级醇提物及分离纯化得到的15种化合物进行了细胞学保肝活性筛选。毛胶经40%、70%和95%乙醇溶剂萃取过滤静置干燥后得到4个组分。以L-02过氧化氢损伤模型研究蜂胶分级提取物的保肝功效。结果显示70%醇溶组分和95%醇溶组分具有很好保肝活性，在50 μg/mL的浓度下，70%醇溶组分保肝活性最高。

采用多次柱层析分离、制备型高效液相色谱并结合液相-质谱联用(LC-MS)从70%醇溶组分中分离纯化鉴定了 15种化合物：黄酮类4种：芹菜素、白杨素、杨芽黄素、5-甲基木犀草素；黄酮醇类5种：山奈酚、3，7-二甲氧基槲皮素、槲皮素、异鼠李素、高良姜素；二氢黄酮类1种：松属素、二氢黄酮醇类2种：短叶松素、短叶松素-3-醋酸酯；苯乙烯酸酯类3种：咖啡酸苯乙酯、咖啡酸肉桂酯、咖啡酸卞酯。细胞学筛选结果显示对L-02过氧化氢损伤具有保护作用的有7种成分——槲皮素、3，7-二甲氧基槲皮素(TDF)、高良姜素、松属素、咖啡酸苯乙酯、咖啡酸肉桂酯和咖啡酸卞酯，这些成分的保肝活性存在剂量依赖关系，活性与浓度成正比，具有极显著的统计学差异。

其他成分未见保肝活性，其中山奈酚加重了过氧化氢诱导的肝细胞损伤。各种肝损伤的共同发病机制为氧化应激，细胞可以适应氧化应激增加到一个临界值。当细胞内活性氧水平过高就会引起氧化应激过度，会损伤细胞的功能或者造成不可逆转的损伤最终导致细胞死亡。氧化应激除对肝细胞有直接损伤作用外，还可激活Caspase-3的活性，诱导肝细胞凋亡。

采用吉姆萨染色和流式细胞仪测定细胞凋亡率的方法证明蜂胶活性化合物高良姜素、松属素、咖啡酸苯乙酯、咖啡酸肉桂酯和咖啡酸卞酯可以有效的降低过氧化氢诱导的L-02细胞凋亡；采用DCFH-DA荧光探针测定细胞ROS水平和Caspase-3活性试剂盒检测Caspase-3的活性对蜂胶活性成分对细胞凋亡通路的影响做了初步探究。实验结果表明蜂胶活性成分可以有效降低H202诱导的L-02细胞ROS水平，降低氧化应激激活的Caspase-3活性，减少受损细胞的凋亡。

（来源：蜂胶活性成分抗肝细胞氧化损伤及凋亡机制研究，俞斌，福建农林大学）